GNAS1低甲基化在胰岛素瘤细胞增殖失控中作用的研究

Uncontrolled cell proliferation plays an important role in the pathogenesis of insulinoma. GNAS1 exerts its pro-proliferation effects on islet cell through the cAMP signaling pathway. Our preliminary work indicated that either GNAS1 mRNA or protein expression level was significantly up-regulated in human insulinoma tissue and cell line, while tumor GNAS1 gene methylation level was down-regulated as compared with the peri-tumoral normal tissue using DNA methylation microarray analysis. Therefore we speculate that the low methylation level results in increased GNAS1 mRNA and protein expression, which activates the cAMP signaling pathway persistently and induces islet cell uncontrolled proliferation, finally the incidence of insulinoma. To investigate this central hypothesis, we will carry out experiments in insulinoma tissue, cell lines and xenografts in nude mice though methylation-specific PCR, RNA interference, and other state-of-the art techniques. As the plasma Gsα activity may reflect the extent of tumor GNAS1 methylation appropriately, we will explore its clinical application using it as insulinoma biomarker. The proposed study will lead to new strategies for the prevention and treatment of insulinoma.

GNAS1蛋白通过cAMP信号通路促进胰岛细胞增殖，而细胞增殖失控是导致胰岛素瘤发生的主要机制之一。本课题组前期研究证实胰岛素瘤组织和细胞株中GNAS1表达均明显升高；DNA甲基化芯片发现，胰岛素瘤GNAS1基因甲基化水平明显低于瘤旁组织。本研究将采用甲基化特异性PCR、RNA干扰等技术，在细胞、组织及动物水平进一步深入探讨GNAS1低甲基化在胰岛素瘤发生中的作用及其分子机制。同时考虑到血浆Gsα活性可较好反映瘤体GNAS1甲基化程度，故本研究还将初步探索其作为胰岛素瘤生物标记物的可能性。通过本研究，将提出并验证新的胰岛素瘤发生机制：GNAS1低甲基化导致GNAS1高表达，进而持续激活cAMP信号通路，致胰岛细胞增殖失控，最终导致胰岛素瘤的发生。通过本研究将为胰岛素瘤的早期诊断及治疗提供新思路。

本课题组前期利用收集的胰岛素瘤和瘤旁组织进行Infinium® HumanMethylation450 BeadChip芯片杂交，发现多个基因甲基化水平在两组标本中存在差异。然后按照以下原则进行生物信息学分析：重点关注甲基化水平在癌组织中高于癌旁组织的位点(liu_Delta_Beta>0)，尤其是在细胞凋亡信号通路和胰岛素信号通路中的基因（共筛选出13个兴趣基因）。进一步用亚硫酸氢盐测序扩增子（BSAS）法对上述基因的13个甲基化差异位点和PDX1的3个甲基化差异位点进行验证分析。两种方法得到的数据作相关分析，皮尔森相关系数为0.852，说明用BSAS方法验证得到的CpG位点甲基化水平与芯片结果基本相符。. Gata6在调控胰岛细胞的分化调控的过程中发挥重要作用，亦参与体内一些肿瘤的形成，基因杂合突变可导致不同起病特征的糖尿病。因此课题组对Gata6在胰岛素瘤细胞株（MIN6）增殖和凋亡中的作用和机制进行深入研究。Gata6无论在mRNA还是蛋白水平在胰岛素瘤瘤体组织表达均显著高于瘤旁组织；siRNA干扰Gata6表达后，细胞发生凋亡较对照组显著增加，细胞周期分析，处在S期细胞减少；过表达Gata6对MIN6细胞的细胞周期无明显的影响，BrdU染色阳性率细胞无统计学差异，提示过表达Gata6对细胞的增殖无明显的作用。棕榈酸可使MIN6细胞产生内质网应激，ROS产生增加，Bcl-2/Bax比值减少。过表达Gata6可减少PA导致的ROS的产生，Bcl-2/Bax比值增加。因此推测Gata6在胰岛素瘤中高表达，通过减少内质网应激所致瘤细胞凋亡，从而参与胰岛素瘤发生机制。