CTGF基因低甲基化在肝星状细胞活化表型维持及肝纤维化形成中的作用研究

Hepatic stellate cells (HSC) sustained activation have a decisive impact on hepatic fibrogenesis. Our recent studies have shown that connective tissue growth factor (CTGF) gene hypomethylation may be mediated maintenance of HSC activation phenotype, suggesting that may play a key role in hepatic fibrogenesis. In this study, we prepare to adopt primary rat HSC, rat model of hepatic fibrosis and liver biopsy specimens of patients with chronic liver disease, to assay the dynamic variation of CTGF promoter methylation, cell genomic DNA methylation and DNA methyltransferase in primary rat HSC phenotypic conversion and liver fibrogenesis by using molecular biology、Real-Time PCR、Western Blot and high-throughput sequencing technology. We also investigate the effect of intervention the CTGF promoter methylation on HSC phenotype transform and maintenance. The aim of this study is to preliminarily elucidate the molecular mechanism that regulate these effects, which reveals the crucial role played by the CTGF gene hypomethylation in HSC activation phenotype maintenance and hepatic fibrogenesis, and provides a theoretical basis and new ideas for clinical intervention or reverse liver fibrosis.

肝星状细胞(HSC)持续活化对肝纤维化形成有决定性影响。我们的预实验结果提示结缔组织生长因子(CTGF)基因低甲基化可能介导了HSC活化表型的维持，提示其在肝纤维化形成中可能起关键作用。本研究拟通过大鼠原代HSC、大鼠肝纤维化模型及慢性肝病患者肝活检标本，采用分子生物学、Real-Time PCR、Western Blot及高通量测序等技术，从细胞、组织以及动物整体模型和患者标本等多方面探讨CTGF启动子甲基化、基因组DNA甲基化及DNA甲基转移酶在大鼠原代HSC表型转化和肝纤维化形成中的动态变化规律；以及干预CTGF启动子甲基化对HSC表型转化及维持的影响，明确CTGF基因低甲基化在HSC活化表型维持对肝纤维化形成的调控机制。本研究将从CTGF基因低甲基化这个新视点为肝纤维的发生机制奠定基础，为肝纤维化的临床干预或逆转提供理论依据和新思路。

肝星状细胞（HSC）持续活化对肝纤维化形成有决定性影响。我们的预实验结果提示结缔组织生长因子(CTGF)基因低甲基化可能介导了HSC活化表型的维持，提示其在肝纤维化形成中可能起关键作用。本课题通过大鼠原代HSC及大鼠肝纤维化模型，采用现代基因分子生物学手段，从细胞、组织以及动物模型等多层次阐明CTGF启动子低甲基化在HSC活化表型维持及肝纤维化中的作用，探讨肝纤维化形成过程中的部分表观遗传学机制。本课题首先建立CCl4诱导的肝纤维化大鼠模型，提取肝脏中的原代肝星状细胞并培养。借助质粒转染技术，获取CTGF高表达的肝星状细胞。CTGF转染后的HSC细胞继续培养，逐渐出现纤维细胞，进一步应用Real-Time PCR及Western blot技术对细胞中CTGF mRNA及蛋白表达水平进行检测。此外，获取肝纤维化大鼠模型的肝组织，进行肝脏纤维化程度和肝星状细胞的CTGF启动子甲基化水平进行评估。体外细胞学实验证实，转染CTGF质粒的HSC，呈现CTGF高表达（RT-PCR和Western blot均证实）。与对照组相比，CTGF高表达的HSC更多的转化为成纤维细胞，这提示CTGF促进HSC向成纤维细胞转化。使用5azadCyd抑制CTGF启动子甲基化后，能够显著降低HSC细胞向纤维细胞转化。此外，CCl4诱导的肝纤维化大鼠模型，分析其肝脏纤维化程度和肝脏HSC细胞内CTGF启动子甲基化水平，我们发现，CTGF启动子甲基化程度越低，则肝脏纤维化程度越重，即大鼠肝脏纤维化程度与肝内HSC的CTGF启动子甲基化程度呈负相关（R=-0.80，p<0.001，n=12）。以上结果均表明CTGF启动子甲基化在肝纤维化发展中起重要作用，CTGF启动子甲基化可能抑制了肝纤维化的发展。该研究从CTGF基因低甲基化这个新视点为肝纤维的发生机制奠定理论基础，为肝纤维化的临床干预或逆转提供理论依据和新思路。