TLRs介导的固有免疫通路在肝移植术后早期移植物失功中的作用及其对缺血型胆道病变的影响和机制研究

The incidence of ischemic-type biliary lesions (ITBL) after liver transplantation is as high as 15%-30%. And 15% of ITBL recipients need retransplantation. Clinical analysis showed lower morbidity of ITBL for hepatocellular carcinoma patients long-term using sorafenib after liver transplantationc. As a multikinase inhibitor, sorafenib can suppress the MEK signaling. Besides, we found in preliminary experiment that MEK downstream signaling events were activated and subset of innate immune cells changed significantly in liver graft and periferal blood of patients with occurrence of early allograft dysfunction (EAD), using expression profiles sequencing analysis and flow cytomery. We hypothesized that EAD and ITBL after liver transplantation was likely to be a continuous process, in which the innate immunity in the EAD persisted and led chronic damage to liver graft, especially to the biliary system, eventually gave rise to ITBL. In the current project, we will establish warm and cold ischemia induced ITBL models, and explore the potential innate immune pathways involved in the ITBL using TLRs-/- and RIG-I-/- mice. We will also make a further research on mechanism of downstream proteins and molecules, in related pathways, on EAD and ITBL. The study will provide potential targets for ITBL prevention and treatment, more effectively decreasing graft loss.

肝移植术后缺血型胆道病变（ITBL）发生率高达15%-31%，其中15%的ITBL需行再次移植。临床肝癌肝移植分析显示：术后长期服用索拉非尼的受者ITBL发生率明显偏低。索拉非尼作为多激酶抑制剂，其重要的机制是抑制MEK信号传导。而我们在预实验中通过表达谱测序分析和流式检测发现，发生早期移植物失功（EAD）的患者移植肝和外周血样本中MEK下游信号激活，且固有免疫细胞亚群改变明显。我们推测：肝移植术后EAD与ITBL可能是一个连续的过程，EAD中发生的固有免疫持续存在并对移植肝尤其是胆道系统造成慢性损伤，最终导致ITBL。因此，我们拟通过热缺血和冷缺血诱发ITBL 模型，采用TLRs和RIG-I缺陷小鼠寻找ITBL涉及的固有免疫通路，进一步通过体外实验研究相关通路下游蛋白和分子在EAD和ITBL发生中的作用机制。该研究将为肝移植术后ITBL提供潜在的预防治疗靶点，更有效的防止移植物丢失。

肝移植术后慢性移植物失功是导致移植物丢失的最主要原因，其中缺血型胆道病变（ITBL）在肝移植术后的发生率高达 15%-31%，我们在前期实验中通过表达谱测序分析和流式检测发现，发生早期移植物失功（EAD）的患者移植肝样本和移植术后5天外周血样本的 MEK 下游信号激活，且外周血固有免疫细胞亚群改变明显，提示固有免疫可能与ITBL关系密切。我们进一步在缺血再灌注模型和小鼠肝移植模型基础上分别建立热缺血和冷缺血诱发 ITBL模型，利用 TLR3、 TLR4、 TLR7、 TLR8、 TLR9、 RIG-I 缺陷小鼠寻找 ITBL 涉及的主要固有免疫通路，发现TLR3缺陷后，肝损伤显著减轻，几乎不发生炎性细胞的侵润。在表达谱芯片分析中，发现了小鼠低灌注肝脏中出现了大量B细胞特异性分子，FACS分析低灌注小鼠肝脏淋巴细胞中T、B细胞的变化，结果提示，低灌注3天后小鼠肝脏中出现了大量B细胞侵润；进一步通过TLRs缺陷鼠发现，TLR3缺陷后，B细胞侵润显著降低，提示B细胞侵润可能与TLR3途径高度相关。TLRs 家族介导的信号途径的特征之一是依赖胞质区的衔接蛋白如 MyD88、 TIRAP、 TRIF 和TRAM 进 行 信 号 转 导 ， 不 仅 能 够 识 别 病 原 体 相 关 分 子 模 式，还能够识别非病原体介导的损伤相关分子模式，迅速诱导固有免疫应答、激活转录因子，如核因子 κB、激活蛋白 1和干扰素调节因子。我们通过MBD2缺陷小鼠构建ITBL模型，发现MBD2缺陷后趋化因子CXCL1、CCL2与IL-8发生显著下调，MBD2缺陷后肝脏凋亡细胞显著减少，免疫荧光结果提示MBD2缺陷可以显著减少再灌注后粒细胞与巨噬细胞的浸润，MBD2缺陷可减轻ITBL损伤。MBD2在miR-25、miR-93与miR-106b上均存在结合位点，鉴于miRNA是细胞内重要的负调控因子，该结果提示MBD2缺陷可能是通过促进相关miRNA的表达进而抑制炎症通路。此外，我们既往研究发现丹参多酚酸盐对大鼠移植肝的胆管损伤具有一定保护作用，在此基础上开展了临床实验，结果提示丹参多酚酸盐对DCD供肝移植术后胆管损伤具有保护作用，这为临床上肝移植术后减轻胆管损伤提供了新的治疗方案。