核桃细菌性黑斑病菌VI型分泌系统Hcp和VgrG基因功能研究

Walnut bacterial blight was the most important disease caused by Xanthomonas axonopdis pv. juglanids(Xaj) in worldwide.Type VI secretion system(T6SS) was pathogenic factor which identified in gram negative bacteria in 2006.To investigate the founction of T6SS between walnut and Xaj interactions,especially the two hallmark proteins Hcp and VgrG in the T6SS components.Hcp and VgrG in-frame deletion mutants,complementary strains and overexpression strains were be constructed.Analyze the role of them in pathogensis and hypersensitive reaction,as well as biochemical and biologcial characters subsequently.Constructing the GFP marked Xaj strains,through the interbacterial growth competition assays to reflect the interactions between the pathogens and the endophytic bacteria isolated from walnut tree.Analyze the interactions between Hcp and VgrG proteins use Co-Immunoprecipitation technique. Furthemore,detecting the gene expressional difference in corresponding mutants and wild type strains by qRT-PCR.These expected results will be beneficial for elucidate the pathogenic mechanisms of the pathogen Xaj to the host walnut,and set foundation for the disease controling,even for the new gene loci target by bactericide.

由地毯草黄单胞核桃致病变种（Xanthomonas axonopodis pv.juglandis,Xaj）引起的核桃细菌性黑斑病是核桃生产上的世界性病害。为了阐明最新发现的新型致病相关因子T6SS(Type VI secretion system)在核桃细菌性黑斑病菌中作用，本研究选取其2个标志性蛋白Hcp和VgrG基因功能展开研究。通过构建基因定点突变、互补和过量表达菌株，分析它们在病原菌与寄主互作中的作用，对烟草过敏性反应的影响，以及对病原菌生理生化和生物学特性的影响。构建GFP标记菌株，通过细菌生长竞争试验，分析病原菌对核桃内生菌的作用。用免疫共沉淀技术（Co-IP）研究这2个蛋白的互作。通过荧光定量PCR技术，分析2个标志性蛋白基因的突变对VI型分泌系统其他核心组分基因的表达变化。研究结果将为更好的理解Xaj的致病机制，为病害的防治和寻找新的药物靶标奠定基础。

核桃是我国重点规划和大力发展的经济林果。由树生黄单胞核桃致病变种(Xanthomonas arboricola pv.juglandis,Xaj) 引起的核桃细菌性黑斑病是核桃生产上最重要的世界性病害，可导致绝收，严重阻碍核桃产业的健康发展。VI型分泌系统（type VI secretion system，T6SS）是2006年首次发现的，广泛存在于革兰氏阴性动物病原菌中的与其致病性密切相关的毒性因子。 为了理解病原菌的致病机制，通过分子生物学方法鉴定及阐明其在核桃细菌性黑斑病菌中有无和作用。. 主要研究内容：1）核桃细菌性黑斑病菌(Xaj)T6SS 与致病性关系研究 ；2）病原菌(Xaj)与核桃内生菌中的互作研究；3）病原菌的生理生化特性、抗药性及生物学特性影响研究；4）6型分泌系统及其关键标志基因的鉴定与功能研究。.由于该病原菌前期没有相关基因组序列的报道与公布。根据相关菌株中的保守序列设计引物，PCR扩增并测序Xaj中T6SS核心组分，鉴定该系统的标志性蛋白Hcp和VgrG来证明Xaj中是否存在T6SS。测序结果表明没有得到阳性扩增结果。随后用全基因组鸟枪法（WGS）进行建Paired-End片段库进行全基因组测序，结果表明病原菌基因组大小5149944bp，GC含量65.36%。将基因组序列与NT、 NR、 SWISSPROT、 TREMBL、COG、KEGG等数据库进行blast 比对分析，未能发现基因组中有T6SS核心组分基因。结果表明主要的分泌系统为T3SS，由13个核心基因组成，T4SS，其核心基因有14个。此外还有一般分泌系统由24个基因组成，比对到少量T1SS和T2SS相关基因。. 对核桃植物的转录组进行了测序分析，de novo组装后共获得51,807条Unigenes，进行基于Unigene库的基因结构分析, 获得SSR标记6,244个；共获得28,209条Unigenes的注释结果。 完成了病原菌的16S序列测定和RFLP分析。对病原菌的寄主范围进行了接种实验。对病原菌的生长条件，分离选择培养基，生物膜的形成，多糖的产生等进行了研究。用核桃内生菌与其在体外竞争，表明在一定条件下，病原菌有更强的竞争能力。. 核桃转录组和核桃细菌性黑斑病菌的基因组测序都是国际上较早完成的，但未发表资料。最近有病原菌的基因组序列报道