纺锤体结合蛋白SPAG5通过调控EB1蛋白微管定位增加卵巢上皮性癌对紫杉醇药物敏感性的机制研究

Paclitaxel is the most commonly used first-line drugs of epithelial ovarian cancer chemotherapy, but the mechanisms involved in Paclitaxel resistance is rarely studied intensively. In the previous study, we found spindle binding protein SPAG5 knockdown in ovarian adenocarcinoma cells increase the resistance to Paclitaxel. And the SPAG5 low expression in ovarian high grade serous carcinoma patients’ tumor tissues predicted poor prognosis. Considering the major function of SPAG5 is binding to and controlling the dynamic structure of the microtubules, and microtubule-binding protein EB1 can sensitizing tumor cell to Paclitaxel while binding to SPAG5-SKAP complex, we will study the role SPAG5 play in mediating EB1 microtubule localization and enhancing Paclitaxel sensibility . In this study, we will first regulate the expression of SPAG5 and EB1 in ovarian adenocarcinoma cells and detected Paclitaxel related apoptosis. Confocal laser scan microscopy observation and Co-IP will also be carried out, in order to investigate the influence of SPAG5 expression level on EB1 localization and microtubule structure in ovarian adenocarcinoma cells. Furthermore, we will construct SPAG5 mutant protein of key structures (C-term structure, uKHC homodomain, Bipartite Nuclear Localization Signal) to investigate the mechanisms involved. Finally, we will establish a subcutaneous xenotransplanted tumor model to verify the function of SPAG5 in mediating EB1 microtubule localization and enhancing Paclitaxel sensibility. We will dig into the role SPAG5 play in Paclitaxel resistance in this study and provide theoretical basis for individualized treatment of epithelial ovarian cancer patient.

紫杉醇为上皮性卵巢癌一线化疗中最常用药物之一，其耐药机制研究较少。本项目前期研究发现卵巢腺癌细胞敲降纺锤体结合蛋白SPAG5可降低其紫杉醇敏感性， SPAG5低表达的卵巢高级别浆液性癌患者预后差。由于SPAG5可结合并调控微管功能，且微管相关蛋白EB1一方面可结合于SPAG5-SKAP复合体，另一方面可增加肿瘤细胞对紫杉醇敏感性，我们将研究SPAG5调控EB1微管定位增加紫杉醇敏感性的机制。本项目将在体外调控SPAG5与EB1表达，证明SPAG5通过EB1增加紫杉醇相关细胞凋亡，再通过激光共聚焦显微镜观察及Co-IP研究SPAG5、EB1与微管的相互作用，并对SPAG5关键功能域（C-末端微管结合域，uKHC同源结构域，核定位结构域）突变失活以进一步研究SPAG5与EB1作用的具体机制。最后将在裸鼠体内验证SPAG5对紫杉醇药物敏感性的调控作用。本项目研究将为患者的个体化治疗提供理论依据。

本项目前期研究中发现， SPAG5低表达的卵巢高级别浆液性癌患者预后差。也有研究指出，微管相关蛋白EB1可结合于SPAG5-SKAP复合体，参与紫杉醇药物敏感性的调控。基于以上基础，本项目深入研究了SPAG5与EB1对紫杉醇耐药的影响。研究中通过检测卵巢癌细胞中SPAG5的表达与紫杉醇对细胞活性抑制率之间的关系发现，SPAG5的低表达与紫杉醇耐药相关，流式细胞学检测及Western Blot检测均显示，紫杉醇处理下SPAG5表达下调增加卵巢癌细胞凋亡，但此时细胞自噬增加，结合IC50结果我们认为SPAG5对紫杉醇药物敏感性的影响可能与自噬有关。与此同时，细胞经紫杉醇处理后细胞中SPAG5表达水平下降，因此，紫杉醇处理本身也可能改变细胞的药物敏感性。另外，在卵巢癌患者中，EB1高表达者在经过含紫杉醇方案的辅助化疗后，预后较低表达者好，EB1高表达可通过降低细胞凋亡增加细胞对紫杉醇抵抗力。但是，免疫共沉淀实验结果提示EB1与SPAG5无直接相互作用，患者肿瘤组织中蛋白的检测也显示两者的表达水平并无相关性，且SPAG5的敲降也不会影响EB1的微管结构定位。因此，SPAG5与EB1两者之间，在紫杉醇药物敏感性的调控中并无直接相互调控作用。BioGRID网站预测SPAG5可与PLK1结合，而有研究指出PLK1可直接磷酸化激活BRCA1。本项目的研究中通过免疫共沉淀检测验证了SPAG5与PLK1的直接相互作用，IC50曲线与细胞凋亡均提示，卵巢癌细胞中SPAG5的低表达降低细胞对顺铂药物敏感性。在顺铂处理下，DNA损伤修复相关蛋白BRCA1的活性也在SPAG5敲降后出现增强。综上，我们认为SPAG5对卵巢癌顺铂耐药性的影响，可能通过PLK1对BRCA1的功能调控来实现。卵巢癌铂耐药一直是妇科肿瘤医生最为关注的治疗难点，严重影响患者预后，本项目研究将为后续工作提供基础，为卵巢癌铂耐药及患者的个体化治疗提供新的理论支持。