植物分泌物中靛蓝合成关键酶的鉴定、分离和纯化及其编码基因的鉴定

靛蓝被广泛地用于印染、医药和食品工业，现代主要依靠化学合成。化学合成严重污染环境，并且产生致癌废物。人们被迫寻求环境友好、不产生有害副产品的有效的靛蓝合成新途径，重新寄希望于靛蓝的生物合成。靛蓝本是以菘蓝为代表的靛蓝植物的次生代谢产物，但申请人发现，靛蓝植物和许多非靛蓝植物的分泌蛋白在一定的条件下都能够在体外在常温下以特定的底物合成靛蓝（肖兴国等，发明专利ZL200610114484.8）。分泌蛋白中哪种或者哪一类酶催化合成靛蓝还不清楚。本申请项目拟以菘蓝和拟南介为试材，鉴定、分离和纯化这种（些）酶，研究其理化性质，测定其氨基酸组成和寻求其编码基因，在为靛蓝体外生物催化合成新途径提供理论支撑的同时，为其编码基因的克隆和高效的生物合成靛蓝体系的建立和完善奠定基础。

植物源靛蓝类色素是人类认知和利用最古老的色素之一，用途广泛。人们普遍认为，植物体内靛蓝类色素的合成起始于吲哚的氧化和吲哚酚的生成。但是，催化这一关键反应的酶一直没有被分离和纯化到。本项目在前期工作的基础上，经过三年的研究，成功地从产靛蓝植物菘蓝（Isatis indigotica F.）叶片中分离纯化得到了能够在体外氧化吲哚生成吲哚酚， 进而生成靛蓝及其同类色素的吲哚羟基化酶，并且对其理化性质进行了比较系统的研究。在此基础上， 对农杆菌介导的菘蓝的遗传转化条件进行了优化，为在不远的将来通过转基因方法提高菘蓝等靛蓝类类色素的含量打下了基础。主要工作和结果总结如下。.1)、首先利用奥博迈耶试剂确定了吲哚酚的快速检测方法，而后通过硫酸铵盐析、透析、两次DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析和吲哚亲和柱层析纯化后，从菘蓝叶片中纯化得到了吲哚羟基化酶。纯化的吲哚羟基化酶能够在体外将吲哚转化为靛蓝及其类似色素。该酶为大小约54 kDa的单体蛋白，最适反应pH值为7.0，最适反应温度为30℃，在酸性条件下活性和稳定性比较好，具有较好的热稳定性。金属离子Mn2+等对酶有激活作用，而Cu2+等有抑制作用；巯基试剂、含硫化合物、还原剂抗坏血酸和一些表面活性剂对酶有强烈抑制作用，而SDS却具有强烈的激活作用。.2）、优化了以农杆菌菌株C58介导的菘蓝（Isatis indigotica F.）遗传转化体系。利用该体系，将微生物源HbpA基因突变体导入菘蓝,显著地提高了转基因菘蓝的靛蓝和靛玉红的含量以及靛玉红对靛蓝的相对含量。.3）、依据本研究的成果和他人的研究成果，修订了植物靛蓝生物合成的途径图。.4）、此外，还顺便分离纯化到PPO等酶。