基于mTOR调控线粒体生物合成探讨黄芪甲苷抗糖尿病肾脏肥大的分子机制

Renal hypertrophy is the major pathological feature in the earlier stage of diabetic nephropathy. The mammalian target of rapamycin (mTOR) stimulates protein synthesis and drive cell growth and proliferation. mTOR also regulates and coordinates mitochondrial biogenesis, which provides energy for cell growth and proliferation. Astragaloside Ⅳ, a Chinese herb monomer, inhibits mTOR activity and regulates mitochondrial biogenesis. Our previous results demonstrated that mTOR was activated and the number of mitochondrial was increased in diabetic kidney. Astragaloside Ⅳ reduced the increased glomerular and tubular size in experimental diabetes. In order to investigate the effect of mTOR on mitochondrial biogenesis and the possible treatment target of astragaloside Ⅳ to diabetic renal cells, rapamycin, a specific inhibitor for mTOR, will be used to down-regulate the mTOR protein level in renal cells under diabetic conditions in this experiment. The aim of this study is not only to clarify the role of mTOR and mitochondrial biogenesis in diabetic renal hypertrophy, but also to define whether the diabetic renal protective effect of astragaloside Ⅳ is dependent on its inhibition of the mTOR and mitochondrial biogenesis. The significance of this project is to provide new Chinese medicine prevention and treatment targets for diabetic nephropathy,and to clarify the molecular mechanisms that astragaloside Ⅳ protect the diabetic kidney.

肾脏肥大是早期糖尿病肾病主要病理特征。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）活化促进蛋白合成，刺激细胞增殖肥大，调控并耦联线粒体生物合成增加为细胞增殖肥大提供能量。中药单体黄芪甲苷可抑制mTOR活化并调控线粒体生物合成。本项目基于课题组前期工作：黄芪甲苷减小糖尿病小鼠肾小球和肾小管的肥大，糖尿病肾组织细胞存在mTOR活化和线粒体数量增加；拟采用mTOR特异性抑制剂雷帕霉素下调mTOR蛋白表达，并应用黄芪甲苷进行干预，通过体内外观察糖尿病状态下肾组织细胞mTOR对线粒体生物合成的调控作用以及黄芪甲苷的干预靶点。旨在明确mTOR和线粒体生物合成在糖尿病肾脏肥大中的作用，及黄芪甲苷糖尿病肾脏保护作用是否依赖其对mTOR和其调控线粒体生物合成的抑制效应。本课题意义在于为糖尿病肾病的中药防治提供新靶点，并阐明黄芪甲苷糖尿病肾病保护的分子机制。

项目背景：肾脏肥大是早期糖尿病肾病主要病理特征。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白活化促进蛋白合成，刺激细胞增殖肥大，调控并耦联线粒体生物合成增加为细胞增殖肥大提供能量。黄芪甲苷对糖尿病肾病有一定保护作用。.研究内容：（1）分别选取db/db及STZ诱导的小鼠作为2型糖尿病模型、1型糖尿病模型。正常组及模型组小鼠给予标准饲料喂养；给药组予含黄芪甲苷药物饲料喂养。实验过程中检测血糖、血肌酐、尿素氮、尿肌酐、24小时尿白蛋白及肾小管损伤指标。观察肾脏肥大损伤相关病理，检测mTOR 及其下游相关指标及线粒体生物合成及功能；（2）分别对NRK52E、SV40-MES13细胞高糖刺激，研究AS-IV和AS-IV及雷帕霉素联合用药对mTOR信号通路及线粒体功能在肾脏细胞肥大增生中的作用。.重要结果及关键数据: （1）黄芪甲苷对2型糖尿病db/db小鼠具有抗肾脏细胞肥大增生的作用：①可显著降低db/db小鼠24小时尿蛋白；②改善肾小球足突融合及肾小球、肾小管基底膜增厚等肾脏肥大的病理基础；③抑制了Akt/mTOR、PCNA、MEK1/2-ERK1/2-RSK2组织细胞增生肥大信号通路；④抑制了过度的线粒体分裂、线粒体自噬；⑤抑制了氧化应激反应。（2）黄芪甲苷对1型糖尿病STZ小鼠具有抗肾脏肥大增生的作用：①降低24小时尿白蛋白；②降低肾脏重量，改善肾小球毛细血管袢面积、系膜外基质堆积、肾小管基底膜厚度；②抑制了Akt/mTOR、4E-BP1、p70S6K、MEK1/2-ERK1/2-RSK2等细胞增生肥大相关的信号通路分子的表达；③提高了肾脏组织mtDNA拷贝数，VDAC含量，融合蛋白OPA1的表达。（3）黄芪甲苷在体外对NRK52E细胞、SV40-MES13细胞具有抗增生肥大的作用：①抑制高糖刺激的NRK52E、SV40-MES13细胞增生；②抑制高糖刺激下mTOR及线粒体合成YY1、线粒体功能TOM20蛋白的过度表达。.科学意义:黄芪甲苷具有抗糖尿病肾脏肥大的作用，与其抑制mTOR通路活化及调节线粒体生物合成和功能有关。为黄芪甲苷临床治疗糖尿病肾病提供了实验证据，为防治糖尿病肾病提供分子靶点。