溶剂冻析蛋白质结晶过程中过饱和度影响机理研究及调控方法的建立

Recent developments in more efficient fermentation technologies led to a shift in the manufacturing bottleneck towards the downstream purification processes using chromatography. Crystallization achieving high purity at low cost has become a new trend in protein purification for replacing chromatography. However, to establish an effective method for controlling the supersaturation during protein crystallization is currently the key factor which restricts the development of protein crystallization. The project here is proposing a novel solvent freeze out （SFO in short） technology which has the potential of overcoming the difficulty mentioned above. The influence principle of supersaturation on protein crystallization will be throughly investigated as well. The thermodynamics and kinetics of crystallization will be studied in the first place. The relationship between the amount of solvent layer and protein supersaturation will be completely quantified. Furthermore, the influence of supersaturation on protein crystal morphology will be revealed by applying SEM and laser particle size analysis. Meanwhile, the crystallization of protein from micelle→nuclei→crystal will be thoroughly discovered at the molecular level using techniques including Dynamic Light Scattering (DLS) and UV spectrophotometer. The principles of the influence of supersaturation on protein crystallization will be thoroughly revealed, based on which an ideal supersaturation control pathway will be established. Results of this project have a significant guiding effect on the application of large scale protein crystallization technology in biological pharmaceutical industry.

随着发酵技术的飞速发展，蛋白质提纯常用的色谱技术由于成本昂贵逐渐成为生物制药进一步发展的瓶颈。结晶技术成本低、效率高，是色谱分离接替技术的首选。然而蛋白质结晶技术成功应用的难点在于结晶过程中过饱和度的调控。本项目针对这一难题创新提出了新型溶剂冻析（solvent freeze out, SFO）蛋白质结晶技术，并对过饱和度影响机理进行深入研究。通过测定结晶热力学与结晶动力学，建立SFO溶剂结晶量与蛋白质结晶过饱和度的对应关系；借助扫描电子显微镜和激光粒度仪等分析手段，探究过饱和度对蛋白质形貌的影响规律；同时，在微观层面上综合动态光散射、紫外可见分光光度计等表征技术深入研究蛋白质聚集态的演变过程，全面揭示过饱和度对蛋白质“聚集态-晶核-晶体”转变过程的影响规律和作用机制；在此基础上构建SFO结晶过饱和度的控制方法。本项目的研究对最终实现蛋白质结晶技术在生物制药中的推广应用具有重要的指导意义。

本项目从宏观与微观角度多尺度研究了过饱和度对蛋白质结晶过程的影响机理，建立了一种蛋白质结晶新技术。. 宏观上，以模型蛋白溶菌酶和脲酶为研究对象，测定了蛋白质结晶热力学与动力学数据，构建了蛋白质结晶相图，建立了溶菌酶与脲酶过饱和度的定量描述方法。在此基础上，深入研究了过饱和度对模型蛋白形貌与活性的影响。结果表明，过饱和度不改变两种模型蛋白的晶型；在脲酶结晶过程中，过饱和度主要影响晶体的粒径与数量；在溶菌酶结晶过程中，过饱和度不仅会影响溶菌酶晶体的粒径与数量，还会影响溶菌酶的晶习。. 微观上利用动态光散射探究了蛋白质聚集体在结晶过程中的动态演变规律，证明了蛋白质成核是分子有序聚集的过程，其推动力来自过饱和度。沉淀剂的加入提高了溶液内的过饱和度，改变蛋白质与水分子间的相互作用，加速蛋白质分子间聚集。不同过饱和度下蛋白质分子的聚集过程不同。在较高过饱和度下，蛋白质分子快速聚集，形成大量晶胚，符合经典成核理论模型。在较低过饱和度下，蛋白质分子逐渐聚集成“蛋白质液滴”，与两步成核理论相吻合。. 本项目开发了一种过饱和度控制的结晶方法，通过对模式蛋白的研究证明了该方案可以有效地控制蛋白质结晶过程。在此基础上，研究了重组左旋-天冬酰胺酶从表达到纯化的全过程，成功得到了纯化后的左旋-天冬酰胺酶晶体。晶体形貌规则，活性良好，建立了蛋白质结晶工业化应用的新技术手段。. 本项目深入探究了结晶过程中“蛋白质聚集体-晶核-晶体”的演变过程，揭示了不同过饱和度下蛋白质的成核机理，对深入理解蛋白质结晶过程具有重要的科学意义。本项目所研发的技术可显著提高蛋白质晶体纯度与质量，不影响蛋白质的活性，可用于高纯度蛋白质晶体的工业化生产，大幅降低蛋白类药物的生产成本，打破蛋白类药物价格昂贵的现状，带来一定的经济和社会效益。