周期方波电场影响蛋白质结晶的规律与机理研究

Obtaining high quality protein crystals is one crucial process for successfully determining molecular structure of proteins via X-ray crystallography, therefore developing methods that can enhance protein crystallization and improve crystal quality is of essential importance. The applicant found in previous studies that, application of a periodic square-wave electric field on crystallization solution could increase the chance to obtain crystals. This result indicated that the studies of protein crystallization under periodic square-wave electric field are potentially valuable in both scientific research and practical application. Thus it is necessary to investigate the effect of periodic square-wave electric field on protein crystallization and its mechanism. Since the driving force of crystallization from solution is the supersaturation, the investigation can begin from the study of the solution concentration distribution that determines the supersaturation. Based on the research, further investigation of the effect of the environment on the crystallization process and crystal quality and their related mechanisms can be conducted, so as to obtain a relatively full understanding of the said subject. Based on the above consideration, the applicant proposed to investigate: (1) protein crystallization process under the periodic square-wave electric field and its mechanism; (2) the crystal quality affected by the periodic square-wave electric field and its mechanism; (3) the probability of developing a new method according to the above research results. The result of this investigation can serve as a good example for developing new methods of protein crystallization.

获取高质量蛋白质晶体是利用X射线衍射解析其分子结构的关键环节之一。因此，发展提高蛋白质结晶成功率及改善晶体质量的方法，具有十分重要的意义。申请者前期研究发现，对蛋白质结晶溶液施加周期方波电场，能提高获得蛋白质晶体的机会。该发现表明，研究周期方波电场下的蛋白质结晶，有潜在的科学意义和实际价值。因此，深入挖掘其规律及相关机理以帮助指导蛋白质结晶实践，很有必要。因溶液中结晶的驱动力是溶质的过饱和度，故可从决定过饱和度的溶质浓度场角度入手，研究其受方波电场的影响，进而研究该环境中蛋白质结晶过程的规律与机理，及该环境影响晶体质量的规律与机理，从而获得较全面的方波电场影响蛋白质结晶过程的知识。据此，申请者提出具体研究：①周期方波电场影响蛋白质结晶过程的规律与机理；②周期方波电场影响蛋白质晶体质量的规律与机理；③基于上述结果，发展新方法的可能性。研究结果将有望为发展新的结晶方法学途径提供有意义的参考。

获知蛋白质的三维结构信息是实现基于结构的理性药物设计的基础，也是理解蛋白质如何执行不同功能的钥匙。因此，获取蛋白质的结构信息十分重要。X 射线单晶衍射技术解析蛋白质结构仍旧是是目前获知结构信息的主要途径，由于该技术需要高质量的蛋白质单晶作为衍射样品，而实现这一点却并不容易。因此，完善蛋白质结晶方法学，研究如何得到高质量蛋白质单晶，至关重要。.针对如何提高蛋白质晶体质量，申请者提出：对蛋白质结晶溶液施加周期方波电场，有可能提高蛋白质晶体质量。实验结果证明，大周期（周期为50min或70min）方波电场能提高测试蛋白质的晶体生长数量，小周期（周期为30s，10min）方波电场可以提高蛋白质晶体质量。.申请者发现，大周期方波电场促进蛋白质结晶过程。以溶菌酶为例，施加电场后，这些带正电的溶菌酶分子以一种非对流形式朝向阴极运动，在阴极周围形成溶菌酶溶液的高浓度区；而在阳极，形成溶菌酶溶液的低浓度区，两个电极之间由此形成了一个浓度梯度。当电极极性反转时，初始有吸引作用的阴极变为阳极，对周围的溶菌酶产生斥力，从而使溶液中的浓度分布再次产生变化，这样就实现了溶菌酶结晶溶液浓度的不断扫描。由于热力学过程会驱使过饱和溶液分离出固相直至溶液达到平衡，蛋白质溶液浓度的起伏提高了溶液达到局部过饱和的机会，促使了蛋白质溶液的结晶。而小周期方波电场环境下，晶体数量减少，晶体发生定向以及晶体质量得到提高。这是由于在小周期下，电场驱动力反复变化方向的频率过快，扰动溶液中的溶菌酶分子，使溶液很难达到稳定状态，会抑制晶体的形核过程。晶体有一定程度的定向是由于溶菌酶分子本身是有极性的，正负电荷分布不均匀。在电场的持续作用下，大量的溶菌酶都会采用相同取向进行运动，会产生“首尾相接”的情况，这种秩序化的出现，导致溶菌酶分子的聚集和取向性结晶。已有研究发现，磁场使蛋白质晶体具有取向作用，生长方向一致的晶体质量得到大幅提高。小周期方波电场导致的晶体取向作用也促使了晶体质量的提高。.对蛋白质结晶溶液施加周期方波电场，驱使带电的蛋白质分子在电极之间不断往返迁移，提高了蛋白质晶体质量。该方法显然对发展新的蛋白质结晶方法学途径有参考价值。该方法为解决蛋白质结晶瓶颈问题提供新的思路，并为发展新的结晶方法学途径提供理论指导和实验依据。