生物钟基因Clock乙酰化酶功能对能量代谢的作用和机制研究

Circadian genes are closely related to metabolism. The latest research indicate that circadian genes can regulate mitochondrial function on transcriptional level. Interestingly, our primary data indicate that huge amount of CLOCK proteins are located in mitochondria, loss of the 19th exon encoding region in CLOCK can reduce the CLOCK’s acetyltransferase activity, and CLOCK can interact with mitochondrial proteins such as cytochrome c oxidase subunit IV. Due to these evidences, we hypothesis that CLOCK may acetylate mitochondrial enzymes and then modulate mitochondria metabolic function, the 19th exon area of Clock gene may contain a putative regulatory region (PRR) which can influence the acetyltransferase activity of CLOCK. First, we will study whether Clock can modulate mitochondrial function by its acetyltransferase by comparing the mitochondrial functions of the Clock-/- and Clock∆19 mice, then we will try to identify the key sites of the PRR that can influence the acetyltransferase activity and hence the mitochondrial functions by using molecular and cellular in vitro methods, finally we will introduce those key sites into mice clock and very their function in vivo. This project will be the first one that studying the CLOCK acetyltransferase and its relationship with mitochondrial functions and energy metabolism at post-transcriptional level, and will open a new field for the molecular mechanism on the circadian proteins.

生物钟基因与代谢密切相关。最新的研究表明生物钟基因可以在转录水平调节线粒体的功能。我们的预实验发现，生物钟CLOCK蛋白大量分布于线粒体，CLOCK蛋白第19位外显子编码区域缺失可降低其乙酰化酶活性，CLOCK与线粒体蛋白之间存在相互作用。由此我们提出：CLOCK可能通过调节线粒体酶的乙酰化来影响线粒体代谢功能，Clock第19号外显子编码区域包含一个潜在的CLOCK乙酰转移酶调节结构域（PRR）。本课题将首先通过比较Clock-/-和Clock突变小鼠的线粒体功能证实CLOCK可以通过其乙酰化酶活性调节线粒体功能；随后在分子和细胞水平上通过分段突变等方法来研究PRR区域影响CLOCK乙酰化酶活性的关键位点；最后通过复制上述关键位点的细胞和小鼠模型，进一步验证其机制。本课题是国内外首次在转录后水平研究生物钟基因对线粒体和能量代谢的调节作用，将为CLOCK蛋白的分子机制研究开拓新的方向。

生物钟基因与代谢密切相关。最新的研究表明生物钟基因可以在转录水平调节线粒体的功能。结合前期结果，我们提出：CLOCK可能通过调节线粒体酶的乙酰化来影响线粒体代谢功能，Clock第19号外显子编码区域包含一个潜在的CLOCK乙酰转移酶调节结构域（PRR），缺失该区域将导致小鼠组织器官功能和代谢紊乱。基于上述假说，我们将研究：Clock第19号外显子缺失（Clcok∆19） 对小鼠节律、代谢及疾病的调节作用；Clock对线粒体形态功能的调节作用； CLOCK及其19号外显子通过乙酰化酶功能对上述生物学过程调节作用的机制。我们发现ClockΔ19 小鼠表现出显著的活动节律紊乱及多组织器官功能障碍，ClockΔ19小鼠活动表现为昼夜节律紊乱，总活动量减少、骨发育异常以及显著的能量代谢异常和显著的氧化应激反应；ClockΔ19小鼠肝脏线粒体形态异常，以分裂为主，线粒体膜电位下降，ROS显著增加，ClockΔ19小鼠肝脏线粒体电子传递链及呼吸功能下降，Clock-/-细胞系线粒体形态功能障碍，上述结果表明：Clock参与调节了线粒体形态及功能；最后，我们发现ClockΔ19突变导致CLOCK乙酰转移酶活性下降，CLOCK可与BMAL1外大量蛋白质相互作用，其中包括部分线粒体蛋白，CLOCK通过影响SLC25A10的乙酰化调节线粒体葡萄糖代谢，通过乙酰化NF-kB影响骨关节炎的发生，综上，CLOCK可在转录后水平通过与多种蛋白质相互作用及乙酰化酶的功能发挥作用。.本研究证实核心生物钟蛋白CLOCK除作为转录因子外，还可作为乙酰转移酶，通过调节核NF-κB以及SLC25A10的乙酰化从而参与到包括线粒体代谢等多种生理活动过程中，进而影响多种组织器官的功能。而在这一过程中，CLOCK的19号外显子发挥了至关重要的作用。这一发现为理解由生物节律紊乱导致的机体障碍提供了新的补充和角度，也为进一步阐明生物钟、线粒体代谢以及组织器官功能之间的关系提供了有力的证据，同时也为多种代谢障碍、衰老、骨关节炎等疾病的防治提供了理论依据。