生物钟基因Clock转录后调节作用对线粒体功能和衰老的影响与机制研究

The tight relationship between altered circadian rhythm and aging is undeniable. In our previous studies, we have found that multiple organs such as liver, kidney, bone in Clock mutant mice showed significant aging phenotype. Besides, in mitochondria, CLOCK puts up another two post-transcriptional regulation functions. Firstly, CLOCK is involved in maintaining mitochondria dynamics balance by regulating the degradation of Drp1 mRNA. Secondly, CLOCK also locates in mitochondria and binds to several mitochondrial genome coded mRNAs. Based on above findings, we hypothesize that circadian gene Clock can maintain mitochondria function and influence aging process by directly regulating mitochondrial fission and mitochondrial mRNA stability. In the following research, we will illuminate the detailed molecular mechanisms of CLOCK’s aforementioned functions firstly, including its mitochondrial location manner, related molecules changes after CLOCK binding to mitochondrial mRNAs and its role in affecting mitochondrial fission. Secondly, we are going to explore the molecules and signal pathways involved in the association of disordered circadian rhythm and aging process in vitro. Finally, gene mutation and gene therapy technologies in mice will be applied to verify the suggested circadian gene functions and related mechanisms. Our research will provide experimental foundation for the delay of aging and treatment of aging related diseases.

生物节律改变与衰老之间存在诸多联系。我们发现生物钟基因Clock突变的小鼠肝、肾、骨骼等多个器官表现出明显衰老，并且CLOCK蛋白具有2个新的转录后调节功能：1 通过调节细胞Drp1 mRNA的降解，维持线粒体形态和功能的动态平衡；2 能够定位到线粒体，并结合多个线粒体基因编码的mRNA。基于上述研究结果，我们提出假说，CLOCK可以通过直接调节线粒体的分裂和线粒体编码mRNA的稳定性，来调控线粒体功能并影响衰老进程。我们将首先阐明CLOCK上述作用的具体分子机制，包括如何调节线粒体分裂，CLOCK的线粒体定位序列、调控线粒体编码mRNA的功能；随后通过分子和细胞水平的实验，进一步研究生物节律紊乱导致的线粒体改变从而影响衰老的分子机制；最后利用基因突变和基因治疗技术在小鼠体内验证上述作用对衰老的影响，为防治生物节律紊乱导致的衰老提供实验基础。

生物节律改变与衰老之间存在诸多联系。昼夜节律基因如Clock、Bmal1、Cryptochrome1/2和Period1/2/3构成了精确的昼夜节律系统。Clock△19是一种常用的小鼠模型，含有昼夜钟基因突变，缺少EXON-19编码的51个氨基酸。我们之前研究发现Clock△19的小鼠肝、肾、骨骼等多个器官表现出明显衰老并伴有有严重的代谢异常。并且CLOCK蛋白具有2个新的转录后调节功能：1 通过调节细胞Drp1 mRNA的降解，维持线粒体形态和功能的动态平衡；2 能够定位到线粒体，并结合多个线粒体基因编码的mRNA。基于上述研究结果，我们提出假说，CLOCK可以通过直接调节线粒体的分裂和线粒体编码mRNA的稳定性，来调控线粒体功能并影响衰老进程。在这里，我们报告Clock△19小鼠的线粒体表现出过度分裂和功能障碍。我们还证明了CLOCK通过其EXON 19与RNA结合蛋白PUF60结合。此外，我们发现PUF60通过调节Drp1 mRNA的稳定性直接维持线粒体稳态，而与CLOCK的关联可以竞争性地抑制这一功能。在Clock△19小鼠中，Clock△19释放PUF60，导致Drp1 mRNA稳定性增强和线粒体持续分裂。我们的结果揭示了CLOCK在通过Drp1 mRNA稳定性调节线粒体稳态中的直接转录后作用，并且Clock△19小鼠中CLOCK的EXON 19的缺失导致严重的线粒体稳态障碍。此外我们还发现，CLOCK的乙酰化酶功能可以通过调节PDIA3的乙酰化，进而影响软骨发育，并导致小鼠关节的早衰，恢复PDIA3或者CLOCK可以恢复其骨关节功能；我们也发现，miR-455是一个非常重要的CLOCK去稳定物，miR-455在ClockΔ19小鼠中显著下调，且昼夜节律消失。CLOCK和BMAL1形成异二聚体结合在miR-455的启动子E-Box区域，转录调控miR-455的表达，并且miR-455的表达呈现昼夜节律。与此同时，miR-455-5p通过与Clock基因的3’非翻译区结合，进而调控昼夜节律。总之，我们发现了CLOCK与线粒体代谢及其与衰老相关病理如肿瘤、心衰、节律紊乱、之间的密切关系，我们的结果将为生物钟节律与疾病的关系提供重要的病理生理学基础。