新城疫病毒劫持AKT/mTOR信号途径调控自噬和凋亡交互对话的机制研究

The crosstalk of autophagy and apoptosis plays a key role in maintaining cellular homeostasis and determining cellular fate, as well as two major interconnected host cell responses against viral infection. Newcastle disease is an important disease in the poultry industry. Previous studies have shown that autophagy and apoptosis play significant roles during Newcastle disease virus (NDV) infection. Based on our previous results, inhibition of autophagy exacerbates apoptosis, whereas inhibition of apoptosis promotes autophagy in chicken embryo fibroblast cells after infection with NDV. However, the mechanism underlying the crosstalk of autophagy and apoptosis by NDV remains largely unknown. The AKT/mTOR signaling pathway is a well-known pathway for apoptosis and autophagy and may contribute to simultaneous or sequential induction of both processes. We found that NDV could activate AKT/mTOR signaling in DF-1 cell at an early stage of infection, subsequently disrupting AKT/mTOR signaling. Based on our previous studies and latest finding, in this study, we will focus on NDV and viral proteins to further elucidate the molecular mechanism of autophagy and apoptosis regulation by NDV at various levels (body, tissue, cell, protein, and mRNA) and using multiple methods (inhibitors, agonists, overexpression, siRNA, and CRISPR/cas9). Implementation of this project will lead to a better understanding of the pathogenesis of NDV.

自噬和凋亡的交互对话在维持细胞稳态中具有关键作用，也是宿主抵御病毒感染的重要手段。新城疫是危害养禽业的重要疫病之一，自噬和凋亡在新城疫病毒（NDV）感染过程中具有重要作用。我们前期研究发现，NDV感染过程中，抑制自噬可以促进凋亡，抑制凋亡可以促进自噬。但目前NDV调控自噬和凋亡交互对话的机制尚不清楚。大量研究表明AKT/mTOR信号通路可同时负调控自噬和凋亡。同时，我们发现NDV感染鸡胚成纤维细胞早期激活AKT/mTOR信号通路，随后破坏AKT/mTOR信号通路。在前期研究的基础上，结合最新的研究进展，本项目以NDV体内外感染及病毒蛋白为研究对象，用不同的研究手段（药物干预、过表达、siRNA和CRISPR/cas9）从不同层次（机体、组织、细胞、蛋白和mRNA）解析NDV劫持AKT/mTOR信号通路调控细胞自噬和凋亡交互对话的分子机制，进而从新的角度解析NDV的致病机制。

新城疫病毒（NDV）是危害养禽业发展的重要病原之一，其致病机制尚不完全清楚，制约了NDV防控技术的发展。本课题运用抑制剂与激动剂、siRNA、CRISPR/cas9等技术手段构建了不同的NDV强毒株细胞感染模型，通过Western blot等试验方法发现AKT/mTOR信号途径的激活是NDV有效复制不可缺少的。之后本研究通过透射电镜、激光共聚焦、Western blot等试验证明了NDV可引起宿主产生完整自噬，而使用自噬抑制剂后能够在NDV感染后24 h内抑制病毒复制，24 h后促进病毒复制。之后本课题通过抑制AKT/mTOR信号通路的活性，检测细胞感染NDV后自噬相关蛋白的表达情况。结果表明，当AKT/mTOR信号通路的活性受到抑制后，其下游ULK1的Ser757位点磷酸化水平降低，从而促进自噬。同时，随着自噬水平的增加，NDV的复制水平在感染前期得到促进，但在感染后期受到抑制，与抑制自噬时的现象相反，进一步证明了自噬对NDV复制的作用，也表明NDV能够通过AKT/mTOR信号通路调控自噬，促进自身的复制。本课题之后通过qRT-PCR和蛋白活性比色法试验检测了干预RICTOR基因后NDV感染对凋亡相关因子mRNA转录水平和蛋白活性水平的影响，发现干预RICTOR基因后内源性与外源性凋亡途径的促凋亡相关因子的mRNA转录水平均显著上调，抗凋亡因子显著下调，且凋亡核心蛋白caspase-3蛋白活性显著上调，表明NDV可以在感染过程中靶向mTORC2抑制内源性和外源性细胞凋亡途径。接下来通过干预RICTOR发现NDV可通过mTORC2靶向AKT和14-3-3ε抑制凋亡。之后本课题发现NDV NP蛋白可激活AKT的磷酸化，且干预RICTOR后AKT的激活消失，通过激光共聚焦和CO-IP发现NP与RICTOR存在互作，表明NP在AKT/mTOR信号通路的激活上起重要作用。最后，本课题使用AKT/mTOR信号通路的抑制剂与激动剂处理SPF鸡，并进行NDV的体内感染试验，表明AKT的激动剂SC79可抑制细胞凋亡和NDV引起的病变，但其他试验组由于动物对药物的敏感性不一而没有得到理想结果。综上，本课题证明了NDV感染可通过AKT/mTOR信号通路调控自噬与凋亡以促进自身复制，丰富了NDV的感染致病机制，为NDV的防控提供了科学基础，也为其他副黏病毒科成员的研究提供了思路。