阻断Blimp1／Axl信号序贯调控DC前体细胞分化及后继抗原提呈诱导同种移植耐受

树突状细胞（DC）的分化控制着抗原提呈的终极效应。新近研究提示，Blimp1信号可能作为DC前体细胞（pre-DCs）分化和成熟过程中的一个重要调控子，在DC处理移植抗原的过程中调节相关功能分子表达；Axl信号在促进DC进一步成熟的同时，控制DC的趋化和黏附功能，保证免疫突触的有效形成。本项目拟通过重组慢病毒载体介导的发卡样siRNA基因干预，全程调控供者髓源性pre-DCs中Blimp1/Axl信号的表达，影响pre-DCs分化成熟过程中功能分子序贯表达，观察后继抗原提呈效应，从而验证上述理论假设，并探索诱导同种移植抗原免疫耐受状态的新方法；在此基础上，进而尝试通过对供者外周DCs进行Blimp1/Axl信号调控诱导耐受态的可能性。利用供者pre-DCs和外周DCs诱导耐受态的机制和方法，对临床移植具有现实意义。

树突状细胞（Dendritic cells, DCs）是最重要的抗原提呈细胞，在免疫应答全过程中起着枢纽作用。不同分化和成熟状态的DCs捕捉抗原及激活T细胞等免疫调节能力也不相同。通过对DCs分化基因进行干预，可以影响DCs的成熟及分化状态，进而调控DC的抗原提呈能力。Blimp1（B lymphocyte-induced maturation protein-1）参与调控B细胞的分化及T细胞的稳态和耐受态的形成， Axl信号在细胞的趋化、移动和黏附中具有重要作用，其二者均与DCs的分化和终极抗原提呈效应密切相关。依据研究计划，首先建立了CD34+骨髓干细胞定向分化为pre-DCs和DCs的诱导分化体系。对既往的DCs培养方案作了明显的改进，调整了细胞因子用量、换液方案、细胞弃用方式等关键环节，提高了培养DCs的数量和纯度，明确了pre-DCs分化中细胞因子表达谱系变化的状况，确定DCs的成熟与抗原提呈功能之间的关系，将DCs细分为悬浮、贴壁和混合三大群落，鉴别了三者之间存在的明显免疫学差异，为精确的免疫学研究奠定坚实的基础。同时，建立了两种Blimp1／Axl反义基因治疗方法，包括慢病毒载体Blimp1-shRNA（lenti-Blimp1）、慢病毒载体Axl-shRNA（lenti-Axl）和核转染法Blimp1-siRNA和Axl-siRNA，研究了细胞转染的有效性和毒性，探索出pre-DCs培养体系中有效的基因治疗方案。通过对pre-DCs分化体系的反义基因治疗，明显下调了分化后的DCs中Blimp1和Axl mRNA和蛋白的表达，抑制了DCs的成熟，下调MHC-II分子和共刺激分子的表达，干扰了免疫突触的稳定性；通过体外MLR检测到DCs抗原提呈能力下降，刺激T细胞增殖能力明显下降，提示DCs演变为耐受性DCs。随后建立了体内同种异体移植模型，在移植同时对受者进行耐受DCs共移植（气管移植模型）或尾静脉输注（气管移植、皮肤移植、心脏移植），发现耐受DCs对皮肤移植物无明显保护作用，但可以明显延长心脏和气管移植物的存活。研究结果说明，阻断Blimp1／Axl信号能够调控DC前体细胞分化及后继抗原提呈，最终诱导同种移植耐受。