美洲大蠊提取物调控NLRP3炎性小体对新生儿坏死性小肠结肠炎的疗效及机制研究

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a common severe intestinal inflammatory disease in neonates. Previous studies have found that intestinal injury and inflammation are the two main causes of NEC. NLRP3 inflammasome play an important role in regulating the occurrence and development of NEC, and have an impact on downstream inflammatory cytokines and pyroptosis. Periplaneta Americana (PA) extract can effectively protect gastrointestinal mucosal barrier and play a therapeutic role on NEC. Based on the previous research, we proposed the following scientific hypothesis: PA extract can reduce the release of inflammatory cytokines and the occurrence of pyroptosis by regulating the activation of NLRP3 inflammasome, thereby alleviating inflammation and intestinal injury, and play a therapeutic role on NEC. In this study we will collect the intestinal specimens of children with NEC to test the correlation between the activation of NLRP3 and NEC. With the help of animal and intestinal organoid models and the molecular biology technology, we will further clarify the therapeutic effect of PA extract on NEC and the relevant modulating effects on the activation of NLRP3 inflammasome and pytoptosis. This project introduced organoid research technology in the field of traditional Chinese medicine. The implementation of the project can provide theoretical basis for the treatment of NEC by PA extract, and provide new strategies for NEC treatment.

新生儿坏死性小肠结肠炎（NEC）是一种新生儿期常见的严重肠道炎症性疾病。既往研究发现，肠道损伤和炎症反应是NEC发生发展的主要原因，NLRP3炎性小体在NEC的发生发展中发挥着重要调控作用，对下游炎性因子的释放和细胞焦亡均有影响。美洲大蠊（PA）提取物可有效保护胃肠黏膜屏障，对NEC发挥治疗作用。结合前期研究，课题组提出如下科学假说：PA提取物可通过调控NLRP3炎性小体活化，减少炎性因子的释放及细胞焦亡的发生，进而减轻炎症反应及肠道损伤，对NEC发挥治疗作用。本课题拟收集NEC患儿肠道标本进行检测，明确NLRP3炎性小体的活化与NEC的相关性；并以NEC小鼠及小肠类器官模型为研究对象，采用分子生物学技术，明确PA提取物对NEC的治疗作用及对NLRP3炎性小体的活化及细胞焦亡的调控作用。本课题在中医药研究领域引进了类器官研究技术，项目的实施可为NEC的治疗提供新的思路和方法。

1）溃疡性结肠炎（UC）是一种慢性炎症性疾病，与免疫功能异常密切相关。巨噬细胞作为药物靶标，可用于调节肠道免疫系统和调节炎性微环境，从而减轻UC的炎性反应。美洲大蠊（PA）是一种重要的动物类中药，具有抗炎、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤等作用，尤其在各种创面的修复上，疗效显著。本课题组以PA为原料制备灌肠用温敏原位凝胶（TISG），通过体内外实验验证了其对UC的保护作用 .方法：以羧甲基壳聚糖（CMCS）表面接枝硫酸软骨素（CS），并与醛基化P407（P407-CHO）交联制得PA/CCMTS-P，用于PA的直肠给药。通过体内外实验验证其巨噬细胞的靶向性。通过免疫组化分析PA/CCMTS-P对UC模型肠道损伤的保护作用；ELISA法检测PA/CCMTS-P对炎症反应的调节作用；免疫印迹实验检测PA/CCMTS-P对RIP1/RIP3/MLKL介导的坏死性凋亡（necroptosis）和NLRP3炎性小体活化的影响。.结果： PA/CCMTS-P，其表征为凝胶，相变温度为32.9℃。体外实验结果表明，与游离凝胶相比，水凝胶促进了PA的细胞摄取，而没有引起任何毒性。PA/CCMTS-P在体外和体内均表现出优异的抗炎活性，可修复受损肠黏膜屏障，调节RIP1/RIP3/MLKL介导的坏死性凋亡和NLRP3炎性小体活化。 .结论:直肠给药PA/CCMTS-P在治疗UC方面具有很好的潜力。.2）新生儿坏死性小肠结肠炎(NEC)是新生儿常见的危重疾病之一，早期以内科保守治疗为主，严重者需手术治疗。本课题着眼于探讨和明确PA对NEC发挥保护作用的机制，以提高内科保守治疗的疗效，减少手术并发症的发生。 .方法:石蜡块包埋的回肠节段取自NEC或肠闭锁(IA)手术患儿。新生C57BL/6小鼠予高渗奶灌胃及缺氧刺激后，造NEC模型。体外实验Caco-2细胞加入脂多糖（LPS）刺激，治疗组加入不同浓度PA（康复新液，KFX）。 .结果: NEC患儿存在NLRP3炎性小体的活化。在小鼠NEC模型中， KFX可有效减轻组织病理损伤，保护肠屏障功能。此外，体内外实验显示，KFX可有效减少NEC时的炎症反应，并可显著降低LPS刺激后NLRP3炎性小体的活化及NF-κB p65的表达及ROS的释放。 .结论:PA可能通过抑制NLRP3炎性小体活化，减轻肠道炎症，保护肠道粘膜屏障，从而发挥对NEC的保护作用。