“昆明小白谷”孕穗期耐冷主效QTL qTFSP10精细定位、克隆与功能验证

Low temperature at the booting stage is a serious abiotic stress for rice in areas of high platitude and altitude. Cold tolerance is a complex trait controlled by many quantitative trait loci (QTLs). Our available data showed that a QTL qTFSP10 for cold tolerance at the booting stage has been detected by constructing a Yunnan cold-tolerant Japonica landrace (Kunmingxiaobaigu)-based mapping population. qTFSP10 explained 37.8% of the phenotypic variances. The present study attempts to fine map qTFSP10 with separation populations constructed by the backcrossing rice line containing qTFSP10 with the cold-sensitive japonica cultivar Towada ,indica rice 9311 and Yunhui 290, respectively. Thereafter, qTFSP10 will be clonded by map-based cloning approach using genomic and EST sequences available in the databases. We will validate the function of the candidate gene by gain- and loss- of function analysis and explore the preliminary mechanism for qTFSP10-directed cold tolerance by invstigating the precise expression patterns by RT-PCR and qTFSP10 promoter mediated GUS activity assay.The allelic variation of qTFSP10 will be analyzed with cold-tolerant and cold-sensitive cultivars from Yunnan province and the qTFSP10 NILs as well as transgenic rice will be evaluated and applied in rice development for cold tolrance at the booting stage.

孕穗期冷害是高纬度和高海拔稻区水稻生产中最主要的限制因子之一，其受多基因控制。前期利用孕穗期强耐冷的云南粳稻地方品种昆明小白谷构建定位群体，检测到一个控制孕穗期耐冷主效QTL qTFSP10，效应达37.8%。本研究利用携带qTFSP10家系与冷敏品种十和田、籼稻品种93-11和云恢290杂交、回交构建的回交分离群体，精细定位qTFSP10；根据基因组序列、EST及其表达信息在定位区间内筛选候选基因；采用PCR或RT-PCR克隆、测序，确定候选基因；构建过量和干涉表达等植物转化载体转化对应水稻品种，验证基因功能；经RT-PCR、GUS转基因分析qTFSP10组织表达特征，初步阐明其作用机理；利用孕穗期耐冷云南资源和冷敏感材料，分析qTFSP10等位变异；采用分子标记辅助选择手段，构建qTFSP10近等基因系，经孕穗期耐冷性鉴定，结合转基因材料，综合评价qTFSP10在生产中的利用价值。

本研究在昆明小白谷与十和田的RIL群体鉴定出的一个孕穗期耐冷性主效QTL qTFSP10的基础上，利用RIL群体中的耐冷家系R726与93-11杂交、回交后代分离群体，明确了在标记RM25207-RM1126之间250 kb区间内存在一个孕穗期耐冷性QTL。进一步回交排除其他耐冷QTL的干扰，利用BC3分离群体将qTFSP10定位InDel标记W10-4和W10-7之间约84 kb区间。该区间含有13个ORF，其中1个编码受体激酶2蛋白、3个编码未知表达蛋白、其余的编码编码转座子或转座子，结合EST表达信息，选定2个编码未知蛋白的基因作克隆与功能研究。. qTFSP10定位过程发现有其他QTL，在72个F3家系和50 个BC1F2家系中选取表型分离群体进行全基因组QTL分析。在F3家系中共鉴定出8个QTL，分别位于第1、2、3、8、10号染色体上。在BC1F2家系鉴定出4个QTL，它们与F3家系中定位的QTL所在区间相重叠，即位于4号染色体标记Y33-RM7187之间 qCTB4，其LOD值为8.21（F3）和10.18（BC1F2），表型贡献率为25.77%和29.37%；位于2号染色体标记Y16-Y17之间的qCTB2，LOD值分别为6.15和5.74，解释23.42%和19.13%的表型变异；位于8号染色体标记W66-RM3702之间的qCTB8，LOD值为10.88和9.18，解释21.98%和18.67%的表型变异；qCTB11（qCTB11）位于标记W77和Y82（Y81）间，LOD值为5.11和6.40，解释18.22%和20.07%的表型变异。. 利用分子标记对BC2F2群体选择孕穗期耐冷不同QTL组合的纯合体，分析BC2F3群体低温结实率，结果，随着QTL位点的增加，其耐低温结实能力提高。认为水稻孕穗期耐冷性育种需要多位点聚合得以解决。. 进一步对BC3F1进行连锁标记分析，选择qCTB4单一前景位点的杂合体种植BC3F2代，加密区间标记和表型鉴定，分析qCTB4所在区，将qCTB4定位在RM1018-RM7187之间的约200kb区间。. 利用昆明小白谷和R727家系为亲本，与云南主推品种回交，采用分子标记辅助选择，创新携带孕穗期耐冷性qTFSP10种质3份，并提供利用。