同位素标记完整糖肽质谱分析新方法及其对肝癌血清40kDa糖蛋白分子群标志物的研究

Hepatocellular carcinoma (HCC) is the major primary liver cancer with high mortality and the early diagnosis for HCC is far from satisfactory. Novel mass spectrometry approaches for sensitive and accurate assessment of protein expression, glycan structure, glycosylation level and glycosite of glycoprotein are important, especially for early diagnosis of HCC. The glycan changes of group of sera 40kDa glycoproteins were found in HCC and liver cirrhosis (LC) in our previous study. This group may be the potential glycobiomarker for distinguishing early HCC from LC patients. In this study, a novel strategy based on isotope labeling of intact N-glycopeptide is developed to quantify glycopeptide and non-glycosylated peptides of this goup simultaneously, and obtain pattern recognition of intact glycopeptide microheterogeneity. The non-glycosylated peptides are used as internal standards to obtain site-specific microheterogeneity level on its protein level and the glycopeptides are also used as internal standards to improve accuracy. The pattern recognition of intact glycopeptide of this group of 40kDa glycoproteins may be a more powerful tool to aid diagnosis of HCC than single biomarker.

肝癌具有发病率高和早期诊断难的特点，建立灵敏特异的准确和完整识别糖蛋白蛋白表达量、糖链结构、糖基化修饰程度和糖基化修饰位点变化的新方法，对于肝癌的早期诊断具有重要意义。我们前期研究发现一组分子量40kDa左右的糖蛋白在肝癌中聚糖变化差异大，很可能是肝硬化发展到肝癌的重要早期诊断标志物群。本项目拟建立基于同位素标记的完整N-糖肽的微观多样性的质谱定量解析新方法，同步定量肝硬化和肝癌患者血清40kDa糖蛋白分子群的完整糖肽和非糖肽，可获得完整糖肽的微观多样性的轮廓识别模式。该新方法以这群糖蛋白自身的非糖肽作为内标，可消除蛋白自身含量变化对糖链微观不均一性的影响；并且在此基础上，完整糖肽轮廓识别模式又以各完整糖肽互为内标，可进一步提高40kDa糖蛋白分子群作为标志物识别的准确性。将精细的N-糖链微观差异表达应用于肝癌的预测诊断中，不仅弥补单一指标检测的不足，更为肝癌的糖标志物研究提供崭新的思路。

项目背景：糖蛋白单一位点上糖链微观不均一性(完整糖肽)的解析对研究疾病进程中的蛋白功能非常重要，而针对N-完整糖肽的定性与定量的质谱技术尚有局限。肝癌具有发病率高和早期诊断难的特点，建立完整糖肽的质谱检测新方法，有利于发现肝癌的早期诊断标志物。.研究内容：血清中60%糖蛋白分子量为40kDa左右，切取肝癌和肝硬化血清40kDa条带(40-55kDa)，进行胶上酶解、亲水富集、C-末端16O/18O酶促标记，采用生物质谱(Stepped-energy HCD-MS/MS)进行完整糖肽检测后，运用pGlyco和pQuant软件分别进行N-完整糖肽的鉴定和定量。.重要结果：65次定量结果经过严格质控后发现，IgA2的两条完整糖肽TPLTANITK (Hex5HexNAc5SA1Fuc1) 和TPLTANITK (Hex5HexNAc4SA2Fuc1)在肝癌中显著降低。运用该技术进一步发现，这两条完整糖肽在正常-肝炎-肝硬化-肝癌的疾病进程中，呈现先升高后降低的趋势。Western blot结果显示IgA2蛋白表达与完整糖肽的变化趋势一致，推测完整糖肽的变化可能是由蛋白表达的变化引起的。.科学意义：建立了灵敏特异的检测糖蛋白位点特异糖链结构变化的N-完整糖肽质谱定量新方法，运用该技术筛选肝癌早期诊断糖链/糖蛋白标志物，为研究肝癌糖基化修饰异常的机理提供了技术支持。