短小芽孢杆菌脱毛碱性蛋白酶基因的转录调控机理

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)作为一种重要的工业微生物，产生的胞外碱性蛋白酶具有独特的抗氧化、抗去垢剂以及较高的热稳定性，在洗涤、皮革脱毛等领域表现出极大的应用前景。虽然在酶的纯化、催化特性和基因克隆表达等方面进行了较多的研究，但该蛋白酶基因的转录调控仍不清楚。我们在对短小芽孢杆菌和枯草杆菌基因组的比对分析基础上，预测出多个转录因子，均可能参与该蛋白酶基因的转录调控。本项目拟通过这些调控基因的重组表达，运用生化技术鉴定特异结合该基因启动子的反式调控蛋白，以及与调控蛋白互作的启动子顺式元件和核苷酸序列；进而构建启动子突变体，与报告基因融合，转化短小芽孢杆菌，在细胞水平上研究启动子顺式元件的生物学功能；同时构建调控基因的敲除突变体，用以研究这些调控基因在蛋白酶基因转录中的作用；最终阐明碱性蛋白酶基因的转录调控机理，为加深了解碱性蛋白酶以及遗传操纵短小芽孢杆菌提供理论基础。

碱性蛋白酶是一种重要的工业用酶，广泛应用于洗涤、制革等行业。我们从短小芽胞杆菌 (Bacillus pumilus) BA06菌株中克隆、分离纯化出一个碱性蛋白酶，具有皮革脱毛的功能，命名为脱毛碱性蛋白酶 (DHAP)。本项目首先利用定量PCR等技术，分析了氮、碳源以及盐胁迫对碱性蛋白酶基因表达调控的作用，证实DHAP是BA06菌株的一个主要胞外蛋白酶；盐胁迫在转录水平阻遏DHAP的表达；而且DHAP的转录受到碳氮源的高度调控。第二，对产生DHAP的短小芽胞杆菌 (B. pumilus) BA06菌株的基因组进行了测序，通过基因组比对分析，发现了可能参与碱性蛋白酶基因表达调控的转录因子；第三，克隆、重组表达和纯化了Hpr、SinR和双组分调控蛋白DegU/DegS等调控蛋白，并采用凝胶延迟分析，证实DegU能够直接结合DHAP基因启动子；而DHAP启动子序列中，存在6个Hpr蛋白结合位点；SinR不能结合DHAP启动子。这些结果说明DegU、Hpr等蛋白可能直接参与DHAP基因的转录调控。第四，采用RNA-seq，分析了BA06菌株在整个生长发育过程中全基因组转录动态，揭示了BA06菌株细胞群体在指数生长阶段、停滞期、芽胞发育及细胞衰退期不同类群基因的转录。最后，通过结构模拟和氨基酸序列多重排列选择一些特定位点进行定点突变，筛选出低温活性和热稳定性显著提高的DHAP突变蛋白酶，为DHAP在皮革脱毛等行业中的应用奠定了基础。