短小芽孢杆菌TUBP1抗棉花黄萎病菌活性成分及作用机理研究

Cotton verticillium wilt is cotton cancers. The biological control, used by microbial agents and microorganism, is the effective way to control cotton verticillium wilt. A antagonistic Bacillus pumilus TUBP1, isolated from 15-years cultured cotton field, is regard as research objectives by our project team. The fermented products will get through the liquid fermentation and it will be subject to isolation and identification research of function components by using mordern seperation methods such as HPLC as well as mordern spectroscopic technology including 1D and 2D NMR. In vitro and in vivo activities of active compounds from Bacillus pumilus TUBP1 against Verticillium dahiae Kleb. Effect of dill active compounds on membrane of Verticillium dahiae Kleb by pyridine iodine staining;We assayed the mitochondrial membrane potential (mtΔψ) using rhodamine 123 and detected the antivities of mitochondrial dehydrogenases by spectrophotometry; We observed the ultrastructure by transmission electron microscopy, studied the nuclear fragmentation by DAPI staining, The mechanism of action of active compunds against Verticillium dahiae Kleb were studied. It is provide the theory basis and the technical support for the further development Bacillus pumilus TUBP1 as microbial medicine to control cotton verticillium wilt. At the same time，It will protect our country in biological resources and accelerate microbial the effective utilization of resources as well as promote the local economy development in Xinjiang.

棉花黄萎病是棉花的"癌症"，利用微生物及其制剂进行棉花黄萎病生物防治是有效途径。本课题以南疆连作15年棉花土壤中分离对棉花黄萎病菌具拮抗作用的短小芽孢杆菌TUBP1菌株为研究对象，通过液体发酵获得发酵产物，并用现代分离技术如HPLC以及1D和2DNMR鉴定技术分离鉴定其发酵液中活性成分；离体活体实验确定活性成分对棉花黄萎病菌抗菌活性；碘化丙啶染色法确定其对棉花黄萎病菌细胞膜的影响；罗丹明染色法测定其作用棉花黄萎病菌后线粒体膜电势、XTT法测定线粒体脱氢酶活性、染色法测定线粒体内活性氧含量；透射电镜观察其作用于棉花黄萎病菌后细胞超微结构的改变，共聚焦显微镜观察DAPI染色后细胞核的形态变化；探讨抗菌活性成分可能的作用机理，为进一步开发防治棉花黄萎病的微生物药物提供理论依据和技术支撑，同时，在保护我国微生物资源、加快微生物资源的有效利用和持续发展、以及促进新疆地方经济的发展方面具有重要意义。

棉花黄萎病是棉花的“癌症”，利用微生物及其制剂进行棉花黄萎病生物防治是有效途径。本课题以南疆连作15年棉花土壤中分离对棉花黄萎病菌具拮抗作用的短小芽孢杆菌TUBP1菌株为研究对象，.通过形态观察、生理生化实验、16SrDNA和gyrB的基因序列分析，明确该菌株为阿萨尔基亚芽孢杆菌；利用生长速率法和牛津杯法分别测定发酵液对棉花黄萎病菌抑菌活性，对棉花黄萎病菌菌丝生长抑制率为78.62 ± 3.48%，温室盆栽实验中，TUBP1最大生防效果为43.67%，小区实验，TUBP1最大生防效果为43.07%。.针对粗蛋白，用DEAE F.F和Sephdex-G100进行反复柱层析分离抗菌蛋白，由DEAE F.F、柱层析得到A、B、C、D、E、F六个馏分，抗菌活性表明D馏分（MIC为62.5 μg/mL）和F馏分（MIC 为32.5μg/mL）有抗菌活性，将D馏分和F馏分经Sephdex-G100反复柱层析，D馏分中D1具有抗菌活性，F馏分中F3馏分有抗菌活性，并用SDS-PAGE进行电泳分析，将单一条带已经送中科院上海生科院蛋白质组研究分析中心进行蛋白质鉴定，确定D1馏分为羧肽酶（carboxypeptidase），分子量为45kDa，F3 peptidase T(tr154685475)，分子量为和等电点分别为6.22 kDa和4.82，并考察抗菌蛋白F3稳定性，结果表明 pH对其抗菌活性有影响，在碱性（pH9-10）条件下抗菌蛋白F3与对照组相比抗菌活性差异不显著，酸性（pH3-6）条件下，其抗菌活性降低；温度对抗菌蛋白F3抗菌活性有影响，高温处理（60、80、100℃），抗菌活性降低。.抗菌蛋白TUBP1对棉花黄萎病菌孢子、菌丝、微菌核抑制作用，结果表明不同浓度蛋白（16.5、32.5和62.5μg/mL）对棉花黄萎病菌孢子、菌丝、生物量和微菌核有抑制作用，且呈浓度依赖关系。采用流式细胞仪、荧光显微镜和电镜探讨抗菌蛋白TUBP1对棉花黄萎病菌作用机理研究。流式细胞仪和荧光显微镜实验结果表明TUBP1蛋白可以损伤病原菌细胞膜，K+的过度外排导致细胞膜极化。模拟细胞膜结构模型实验结果表明，抗菌蛋白通过穿孔形式损伤细胞膜，且空洞直径大约在1.4-2.3nm。