苦荞麦抗肿瘤蛋白的结构及构效关系研究

本项目主要对苦荞麦蛋白质的结构及抗肿瘤机理进行研究。通过细胞培养的方法，采用硫酸铵分级沉淀、离子交换色谱和凝胶过滤色谱从苦荞麦水溶性蛋白质中筛选抗肿瘤活性的有效组分，确定合理的技术路线；采用倒置显微镜和扫描电子显微镜对肿瘤细胞形态进行观察，采用流式细胞仪测定细胞周期及癌基因和抑癌基因蛋白的表达，TUNEL法检测细胞凋亡，确定其抗肿瘤机理；采用SDS-PAGE和氨基酸分析仪对抗肿瘤蛋白的亚基和氨基酸组成进行分析；采用拉曼光谱（Raman）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和圆二色性光谱（CD）对其二级结构进行研究；采用紫外差示光谱和荧光光谱考察醇溶液和变性剂对其构象变化的影响。通过对苦荞麦蛋白质结构的研究，探讨其结构与抗肿瘤功效之间的关系。本项目旨在对苦荞麦抗肿瘤蛋白的结构和作用机理进行研究，为苦荞麦资源的深度开发和综合利用奠定理论和技术基础。

苦荞麦是我国特有的小杂粮品种。本课题主要对苦荞麦蛋白质的抗肿瘤活性及结构进行了深入的研究。采用硫酸铵分级沉淀、离子交换色谱和凝胶过滤色谱对苦荞麦水溶性蛋白质（TBWSP）逐步分离纯化，并结合细胞实验，筛选出苦荞麦水溶性蛋白质中体外抗肿瘤活性的有效组分，命名为TBWSP31。体积排阻－高效液相色谱和SDS-PAGE分析表明，TBWSP31为单体蛋白，其相对分子质量为57000。.体外抗肿瘤活性实验表明，TBWSP31对人乳腺癌细胞株Bcap37的生长有明显的抑制作用。HE染色发现细胞经样品作用后，呈现细胞凋亡的明显特征，细胞变形，变小，细胞核固缩、裂解，染色质染成深蓝色或蓝黑色，细胞膜皱褶、卷曲和出泡，并且有细胞膜包裹的凋亡小体生成。扫描电镜下观察细胞表面超微结构，发现细胞出现典型的凋亡形态学特征。.采用流式细胞仪PI单染色法检测TBWSP31对Bcap37细胞周期的影响，结果发现TBWSP31对Bcap37细胞的增殖抑制作用存在时间效应和剂量效应。TBWSP31作用于Bcap37细胞后，G0/G1期细胞比例增加，DNA合成期－S期细胞减少，说明细胞受阻于G0/G1期，可阻滞G0/G1期的细胞向S期转化。采用流式细胞仪FITC-IgG标记法检测TBWSP31对Bcap37细胞作用后癌基因和抑癌基因的变化，结果发现TBWSP31可以上调抑癌基因蛋白Bax和Fas的表达，下调癌基因蛋白bcl-2和突变型p53的表达。.采用CD、FTIR和Raman光谱对TBWSP31的主链构象和侧链环境进行分析，结果表明TBWSP31含有β-折叠、β-转角、α-螺旋和无规卷曲，其中β-折叠的含量较多，C-C-S-S-C-C侧链为反式－扭式－反式构象，酪氨酸残基有的埋藏在疏水环境中，有的暴露于溶剂中，色氨酸残基趋向于暴露。.紫外差示光谱和荧光光谱分析表明，TBWSP31的色氨酸残基和酪氨酸残基有的位于分子内部，有的暴露于分子表面。乙醇溶液使TBWSP31变性时，仅仅是分子的外层结构发生了变化，分子内部疏水核的变化较小或不受影响，高浓度的盐酸胍使位于TBWSP31分子内部疏水核的酪氨酸和色氨酸转移到分子表面，暴露于溶剂中，所处的微环境发生了很大的变化。.研究成果：正式发表SCI 文章3篇，CSCD文章2篇，接受SCI 文章1篇。授权专利一项。