原发性胆汁性肝硬化中自身抗原特异性DC的microRNA调控机制及其在重建免疫耐受中的应用研究

原发性胆汁性肝硬化（PBC）是一种自身免疫性肝病，发病机理不明，发病率逐年升高。目前主要是对症治疗，不能治愈。研究表明，树突状细胞（DC）在自身免疫耐受中起关键作用，microRNA(miRNA)在DC免疫应答调控中发挥重要作用。本研究拟深入研究PBC中自身抗原特异性DC的miRNA调控机制，探讨免疫干预重建PBC自身免疫耐受的途径，具有巨大的学术价值和应用前景。首先分析PBC自身抗原特异性DC中差异表达miRNA及其疾病相关性；经转录因子芯片检测、生物信息学分析、报告基因技术和基因沉默技术研究差异表达miRNA的转录因子依赖性；通过转染差异表达miRNA前体/抑制体，研究其对DC自身免疫应答的调控作用；确定差异表达miRNA的作用靶点及其对DC自身免疫应答的影响；在PBC小鼠模型上，通过注射腺病毒pAd-差异表达miRNA前体/抑制体，研究其对DC自身免疫应答和PBC病程的体内调控作用。

由于当前对于原发性胆汁性肝硬化（PBC）的miRNA异常表达情况以及miRNA在PBC发病机制中的作用还不是十分清楚；本课题原计划使用在单个核细胞诱导的树突状细胞中分析异常表达的miRNA，但在诱导过程中发现此类DC并不能真实反映患者机体的DC功能，且不利于推广miRNA在临床常规检测中的应用，所以我们选用了外周血单个核细胞，该类细胞可真实反映机体的免疫细胞功能及免疫功能状态，而且PBMC的极易获得，所以对于PBMC中miRNA的筛查将更加有利于将来miRNA成为临床PBC的诊断标记物；因此，本课题针对PBC患者外周血单个核细胞中异常的miRNA表达水平进行了检测并对其功能进行了探索。课题已圆满完成，并取得了以下的结果：第一：我们首次发现了PBC患者外周血单个细胞（PBMCs）中确实存在有异常表达的miRNA，其中共有17miRNAs表达异常，11个表达上调，6个表达下调；第二：通过对这些异常表达的miRNA的功能分析发现，上调的11个miRNA分子主要参与调控了机体信号传导、细胞分化、凋亡等功能，而下调的miRNA主要的调控功能有信号传导、离子转运、染色体修饰、细胞增殖等功能，而这些异常表达的miRNA还参与了内吞作用、MAPK信号通路、TGF-β信号通路以及Wnt信号通路、钙离子信号通路等信号通路的调控；第三：我们在原发性胆汁性肝硬化、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、干燥综合征以及病毒性肝炎肝硬化患者中检测PBMCs中miR-106b-5p的表达水平，发现在PBC患者中miR-106b-5p表达显著特异性升高，说明miR-106b-5p具有疾病特异性，随后通过RT-PCR、Western blot、荧光素酶报告基因等方法证实miR-106b-5p可以靶向作用于JAK1。以上这些研究结果为我们将来进一步探讨miRNA作为PBC新的疾病标记物及治疗靶点以及miRNA在PBC发病中的具体机制都提供了理论基础。在本项目资助下，我们发表论文10篇。资助的论文受邀参加2012年第一届全军生物医学技术：基础与临床转化大会，大会发言并获得全军检验检验医学优秀论文二等奖；2013全国检验医学大会，获得优秀论文奖。本课题培养博士1名、硕士2名，其中两名均已毕业。其中博士研究生获得第二军医大学特等奖学金和校长奖学金，硕士研究生获校一等奖学金，并继续攻读博士学位，另有一名硕士拟明年毕业