角膜基质干细胞与脂肪干细胞防治角膜瘢痕的作用和机制研究

Corneal scarring is among the most common causes of poor vision or blindness. Corneal transplantation is the most successful solid organ transplant performed today. But many patients cannot receive the surgery to improve their vision because of lacking of donor tissue. The perspective of stem cell studies on tissue and organ reconstruction brings the hope of using stem cell therapy to replace corneal transplant and improve vision. We discovered and characterized corneal stromal stem cells (CSSC), which can reconstruct the collagen fibrils in the stroma to make the lumican knockout mouse hazy cornea transparent. Adipose-derived stem cells (ADSC) can be induced to differentiate into corneal keratocytes in vitro. When an ADSC pellet was transplanted into a mouse cornea, it became transparent without causing inflammatory response. In this project, we will study the effects of CSSC and ADSC in fibrin gel or on amniotic membrane for preventing and curing corneal scarring. We will (1) optimize the composition of fibrin gel and stem cell density on either fibrin gel or amniotic membrane and discover the biotissue effects on macrophage polarization in vitro; (2) make corneal alkali burn rabbit model to induce corneal scar; transplant the biotissues consisting of CSSC or ADSC on fibrin gel or amniotic membrane at early stage after alkali burn and explore their effects on scar formation and the mechanisms for preventing scaring; (3) transplant CSSC/ADSC biotissues onto alkali burned corneas 1 month after wounding for curing the corneal scar and explore the mechanisms. Our results will constitute a significant body of novel information and lead directly to stem cell-based therapy for corneal scar and provide experimental basis for developing new generation medications in the treatment of corneal scar.

角膜瘢痕是我国低视力及眼盲的主要原因之一。由于供体角膜的缺乏，很大比例的患者得不到角膜移植治疗。干细胞在组织器官重建中的研究和前景为患者带来了希望。我们率先发现了角膜基质干细胞(CSSC)，这些细胞能够重新构建角膜的胶原纤维结构，使小鼠混浊角膜恢复透明；脂肪干细胞(ADSC)能够在体外诱导分化为角膜基质细胞，移植的脂肪干细胞团在角膜中变为透明。本项目研究CSSC、ADSC在胶原纤维凝胶和羊膜上形成的生物组织在防治角膜瘢痕形成中的作用及机制：（1）优化胶原纤维凝胶组织及干细胞密度制备生物组织，探讨干细胞生物组织对巨噬细胞的调节作用；（2）应用碱烧伤制作角膜瘢痕动物模型，早期移植干细胞生物组织防止角膜瘢痕形成，研究巨噬细胞极化及对瘢痕形成的影响；（3）在烧伤后期移植治疗角膜瘢痕并探讨其机制。预期结果将为临床应用干细胞治疗角膜性眼盲提供可靠的科学基础，并为研制治疗角膜瘢痕的药物提供依据。

目的：研究角膜基质干细胞（CSSCs）和脂肪干细胞(ADSCs)在角膜再生中的作用。 .方法：从不同的供体分离、培养、传代并鉴定CSSCs和ADSCs。 并且将这些干细胞长期在液氮中保存后复苏，用核型，克隆形成的效率，以及三维成球形成过程中细胞标记物等方法检测细胞的干性，此外，也从细胞向多胚层分化为骨细胞，脂肪细胞，神经细胞，角膜基质细胞等的能力角度进行分析比对。将细胞置于胶原纤维凝胶中移植于碱烧伤小鼠角膜上评价角膜愈合情况。 .结果： 完整建立了角膜基质干细胞和脂肪干细胞的培养、分离、鉴定、冻存及复苏系统。CSSCs和ADSCs冻存复苏后展现了很好的存活能力，超过90%的细胞表达 CD90, CD73, CD105, STRO1, 和 CD166 等干细胞标记物；此外，也同时表达OCT4, KLF4, 和 ABCG2这些标记物，并可以形成克隆和三维小体。多胚层分化潜能的检测方法展示了来源于不同供体的CSSCs和ADSCs细胞经过长期冻存后均可以分化为骨细胞，脂肪细胞，神经细胞和角膜基质细胞，并表达不同的标记性蛋白。 分泌蛋白组的分析也展示了角膜纤维细胞的损伤修复能力并可以减少纤维细胞标记物SPARC 和fibronectin的表达。 将角膜基质干细胞移植于碱性烧伤的小鼠角膜表面，同样显著促进角膜再生愈合，显著减低了炎性细胞浸润、角膜水肿和角膜瘢痕形成。.讨论： CSSCs和ADSCs细胞在长期液氮冷冻保存后依然可以维持干性以及多胚层分化的潜能，通过这些细胞的分泌蛋白的功能分析，以及促进角膜烧伤愈合的作用，展示了他们在角膜组织再生以及预防纤维化的过程中可以起到非常重要的作用。