JWA调节PERK-mTORC2信号反馈环路维持成骨细胞稳态的机制研究

Current bone biology research focus on mechanisms about osteoblast homeostasis and strategies for enhancing osteoblast activity. Both the unfolded protein response elicited by ER stress and mTOR signaling are important for osteoblast homeostasis, however, the interplay between these two signaling and its contribution to bone remodling are still unraveled. JWA, an ER localized protein, has been revealed as an novel modulator for the osteoblast activity and skeletal dynamic balance. Recently, JWA was found as a negative binding partner for PERK and possibly involved in the signaling crosstalk between PERK and mTORC2-Akt. On the basis of these findings, with the JWA deficiency mice and inducible JWA transgenic mice, JWA inducing agents and comprehensive research methods of bone cellular and molecular biology, current project will further study the detailed mechanisms for the regulation of JWA on the feedback circuit between PERK mTORC2, with emphasis on its role on PERK-mTORC2 complex formation. The findings will further reveal the knowledge about the maintenance of osteoblast homeostasis and provide us the theoretical basis and a credible intervention target for enhancing osteoblast activity and osteoporosis treatment.

探寻成骨细胞稳态维持的具体机制、寻求有效的能够提高成骨细胞活性的干预措施是当前骨骼生物学的研究热点。内质网应激介导的非折叠蛋白反应以及mTOR信号通路均对成骨细胞稳态起重要调控作用，但它们之间的相互调控机制对成骨细胞稳态以及骨骼代谢的影响尚未阐明。JWA是课题组新发现的具备调节成骨细胞稳态功能的内质网应激相关蛋白。本项目前期结果提示JWA作为非折叠蛋白反应关键分子PERK的负性相互作用蛋白，影响PERK-mTORC2-Akt信号反馈环路，是内质网应激与mTOR信号串话的关键转接分子。本项目在此基础上进一步采用基因工程小鼠、JWA激动剂结合骨骼生物学研究手段从影响PERK-mTORC2功能复合物形成这一角度对其调控机制进行深入探讨。本项目预期成果有利于完善成骨细胞稳态维持相关机制的认识，并为新的以改善成骨细胞活性为靶标的骨质疏松的防治措施提供依据。

蛋白质稳态和能量稳态是维持成骨细胞稳态的关键，探寻其背后的具体机制、寻求有效的能够提高成骨细胞活性的干预措施是当前骨骼生物学的研究热点。本项目从非折叠蛋白反应通路PERK-eIF2α-ATF4通路和糖酵解产物乳酸在成骨细胞中的代谢入手，探讨成骨细胞稳态维持的具体机制。项目发现甲状旁腺激素PTH可引起成骨细胞内质网应激反应，激活PERK-eIF2α-ATF4通路和IRE1-XBP1通路。采用针对PERK的特异性抑制剂GSK2604414、AMG’44，针对eIF2α的ISRIB以及PERK-siRNA和ATF4-siRNA抑制PERK-eIF2α-ATF4通路能显著抑制PTH促成骨细胞增殖、分化作用，而采用eIF2α去磷酸化抑制剂salubrinal能增强PTH促成骨细胞增殖、分化作用。PTH通过增加PERK与HSP90的相互作用维持PERK的蛋白稳定性，采用HSP90抑制剂geldnamycin显著抑制PTH促成骨细胞增殖、分化作用。项目发现JWA是新的eIF2α磷酸化调节分子，采用特异性siRNA降低成骨细胞内JWA表达，能显著下调细胞应激诱导剂（TG、Tm、重金属以及氨基酸缺失等）以及促成骨分化因子BMP-2、PTH等所致eIF2α的磷酸化，其机制与JWA缺失增加eIF2α去磷酸化密切相关，但其详细机制有待深入探讨。项目发现作为糖酵解产物的乳酸能显著刺激成骨细胞分化而非细胞增殖，采用针对负责转运乳酸进入细胞的单羧酸转运体1（MCT1）的特异性siRNA或其抑制剂a-CCA、oxamate以及针对负责乳酸在细胞内代谢的乳酸脱氢酶B（LDHB）和丙酮酸脱氢酶（PDH）特异性siRNA能抑制乳酸的促成骨细胞分化作用。乳酸抑制成骨细胞内缺氧诱导因子HIF1α 的羟基化及泛素化，维持HIF1α蛋白稳定性。使用HIF1alpha特异性抑制剂BAY87-2243抑制乳酸的促成骨细胞分化作用。项目发现乳酸处理分别通过PKA和PKC-Gβγ-PLC通路显著增加PTH作用下p38和Akt的活化并增加PTH的促成骨分化作用，采用p38、Akt以及Gβγ和PLC的抑制剂则能显著下调乳酸和PTH共同作用下ALP活性及ALP mRNA水平。项目研究成果有助于进一步揭示内质网应激和乳酸代谢在成骨细胞稳态维持中的作用与机制并为开发新的提高成骨细胞活性的干预措施提供实验依据。