基于单核细胞增多性李斯特菌分选酶SrtA的蛋白组学和免疫蛋白组学研究

Listeria monocytogenes(LM) is a zoonoses listeriosis pathogen and is identified with one of four most important food-borne disease pathogens by WHO.Studies showed that some surface proteins sorted by SrtA play a important role in LM pathogenesis ,but there has been no systematic analysis to identify the major cell wall-associated proteins profile. In our previous study, a LM isolate named LM90 was identified from clinical sheep encephalitis case. In this research, first, to construct srtA deletion mutant with homologous recombination. Second,to establish cell wall-associated proteins profile and to screen new antigenic proteins from cell wall proteins based on SortA in LM90 using proteomics and immuno proteomics approach. Third, to confirmed selected protein's role in cell adhesion and invasion, mouse virulence and other biological characteristics. The achievement of this research can provide a scientific basis for further understanding immune and pathogenic mechanism of LM and for screening drug targets of LM.

单核细胞增多性李斯特菌(LM)是人兽共患李斯特菌病的病原体，被WHO列为的4大食源性致病菌之一。已有研究表明一些基于SrtA分选的表面蛋白在LM的致病中发挥重要作用，但是目前尚没有基于SrtA分选表面蛋白谱的系统研究。本实验室从临床绵羊脑炎病例中分离到的一株LM，命名为LM90株。本研究首先利用同源重组技术构建LM90株srtA基因缺失株，利用蛋白组学技术鉴定LM90野生株和srtA缺失株的细胞壁差异蛋白，通过差异蛋白的鉴定和筛选，生物信息学分析差异蛋白的基序、结构和功能，获得基于SrtA的分选蛋白谱及新的表面蛋白；同时结合免疫学技术对细胞壁蛋白进行反应原性的鉴定、筛选，获得具有抗原性的新表面蛋白；对筛选蛋白构建其缺失株，研究其在细胞粘附与侵袭，小鼠毒力试验等生物学特性中的作用，以期发现新的毒力因子，为进一步了解单核细胞增多性李斯特菌的免疫、致病机制以及筛选药物靶点提供科学依据。

单核细胞增多性李斯特菌(LM)是人兽共患李斯特菌病的病原体，被WHO列为的4大食源性致病菌之一。已有研究表明一些基于SrtA分选的表面蛋白在LM的致病中发挥重要作用，但是目前尚没有基于SrtA分选表面蛋白谱的系统研究。本实验室从临床绵羊脑炎病例中分离到的一株LM，命名为LM90株。本研究首先利用同源重组技术构建了LM90株srtA基因缺失株，采用变溶菌素结合TCA法制备了LM90野生株和srtA缺失株的细胞壁蛋白，应用非标记定量蛋白质组学和生物信息技术完成了细胞壁差异蛋白的筛选和功能的预测；其次通过同源重组技术构建了LPXTG基序蛋白基因lmo2714/lmo0159/lmo0160/lmo0331等的基因缺失株，检测了亲本株与缺失株的生化特性、环境适应性、生物膜形成、对细胞的粘附、侵袭和胞内增殖以及小鼠毒力和脏器载菌量等。研究结果表明：利用非标记定量蛋白质组学技术筛选到36个差异细胞壁蛋白，其中20个蛋白野生株有，缺失株无，7个蛋白野生株无，缺失株有，还有9个表达量差异显著的蛋白。成功构建了4个细胞壁蛋白Lmo2714/Lmo0159/Lmo0160/Lmo0331等的基因缺失株,除LM90SB2△lmo0331显著降低LM在pH9，LM90SB2-△lmo0160/△lmo0159显著降低LM在42℃、0.5%和2.5% NaCl条件下和3.0% 和3.5%EtOH条件下的生长之外，对其他环境的适应性以及生物膜形成能力没有明显改变；但是对HBMEC，MBMEC，RAW264.7，SIEC等不同细胞的粘附、侵袭和胞内增殖能力有显著降低，缺失株对小鼠的毒力下降0.89-1.63个对数级，在感染小鼠后72h内肝脏、脾脏和脑中的含菌量均有所降低。表明Lmo2714/Lmo0159/Lmo0160/Lmo0331蛋白部分的参与了LM的毒力和致病性，Lmo0331参与LM抗碱能力，Lmo0160和Lmo0159参与LM抗高温生长能力。