单核细胞增多性李斯特菌溶血素LLO激活ERK1/2磷酸化的分子机制

The Gram-positive, facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) is the causative agent of listeriosis, a severe foodborne infection with a high mortality rate. The pore-forming toxin listeriolysin O (LLO) is the key virulence factor of L. monocytogenes that enables the bacteria to cross the phagosomal membrane to establish successful infections. Our previous studies showed that LLO is responsible for activation of ERK1/2 signaling molecules phosphorylation during L. monocytogenes infection in human epithelial Caco-2 cells, while the underlying mechanisms remain unknown. In this study, by employing the molecular/cellular/infection biology techniques, such as protein-protein interactions, fluorescence labeling, iTRAQ quantitative proteomics mass spectrometry and gene manipulation approaches, we aim to elucidate: (I) the interactive mechanisms (key domains or active sites) of LLO with ERK1/2 kinases and receptors implied on LLO-dependent activation of ERK1/2 phosphorylation and contributions of these signaling molecules to L. monocytogenes intracellular invasion, escaping, proliferation, survival, and pathogenicity during host infections; (II) the biological roles and underlying mechanisms of bacterial infection-activated ERK1/2 phosphorylation in regulating the inflammatory response and evading the innate immunity for L. monocytogenes. This study will provide novel insights for better understanding of a novel mechanism by which L. monocytogenes modulates ERK1/2 signaling to facilitate intracellular infection and survival by communicating with host molecules and signaling pathways, which will be helpful to develop strategies for reducing the incidence of foodborne disease in public health.

单核细胞增多性李斯特菌是一种食源性胞内病原菌，在侵染宿主过程中利用毒力因子溶血素（listeriolysin O，LLO）裂解细胞吞噬体膜。我们发现李斯特菌感染Caco-2细胞后能够通过LLO将细胞外调节蛋白激酶ERK1/2磷酸化，但具体分子机制未知。因此本项目将在前期研究基础上通过蛋白互作、荧光标记、细菌感染、iTRAQ蛋白筛选等分子生物学、细胞生物学和感染生物学手段解析该病原菌依赖LLO与ERK1/2及其上游关键激酶蛋白的互作关系，确定LLO参与该生物学过程的关键结构域或氨基酸位点，最终探明LLO介导ERK1/2磷酸化的分子机制；阐明李斯特菌感染激活ERK1/2磷酸化对于LLO活性调控以及细菌在胞内感染、生存和应对宿主炎症反应的生物学意义。本研究对于揭示李斯特菌与宿主分子信号途径的“交流”机制及建立针对食源性胞内病原微生物的免疫防控策略具有重要价值。

单增李斯特菌是一种重要的人兽共患食源性胞内病原菌，在侵染宿主过程中利用毒力因子溶血素O（listeriolysin O，LLO）裂解细胞吞噬体膜并介导细菌感染和生存。在前期研究中，我们发现李斯特菌感染肠上皮细胞后通过LLO激活重要MAPK信号通路ERK1/2磷酸化，但具体分子机制未知。本研究利用细菌基因遗传操作、蛋白互作、荧光标记、细菌感染免疫等分子/细胞和感染生物学手段揭示李斯特菌在感染宿主细胞过程中利用LLO调控ERK1/2 MAPK信号通路的分子机制和生物学意义等关键科学问题。研究首次发现LLO作为胆固醇依赖的家族毒素其膜穿孔活性对于李斯特菌感染触发ERK1/2磷酸化至关重要，且LLO进入宿主细胞是激活ERK1/2磷酸化的关键步骤。LLO胆固醇结合基序（T515L516）为LLO触发ERK1/2磷酸化的关键氨基酸位点，突变后无法再激活ERK1/2磷酸化，系统揭示了LLO触发ERK1/2磷酸化高度依赖宿主细胞膜的完整性，该过程与LLO活性的精准调控密切相关，是李斯特菌维持胞内感染生存的重要前提环境。此外，研究首次发现LLO调控ERK1/2磷酸化不依赖该蛋白的PEST序列（该序列被证实与LLO的磷酸化降解有关）。重要的是，研究首次系统阐明LLO能与MAP2K级的蛋白激酶MKK3和MEK1互作，并确定了LLO的互作关键位点为F251和Y255，而MKK3与LLO的互作位点为MKK3的磷酸化位点S218和T222，MEK1与LLO的互作位点为MEK1的磷酸化位点S218和S222，该些位点突变后导致LLO调控MAPK磷酸化水平显著减弱。研究系统阐释了李斯特菌精巧利用LLO与MAPK通路重要激酶互作并激活该信号通路以协助细菌自身在胞内建立感染和生存。.综上，本研究系统揭示了单增李斯特菌重要毒力因子LLO依赖其细胞膜穿孔活性激活ERK1/2 MAPK磷酸化的分子机制以及在细菌感染过程中的生物学意义；首次发现并明确了LLO与MAP2K级的MKK3、MEK1激酶互作关键结构域和位点。本项目对于系统完善李斯特菌等重要胞内病原菌与宿主分子信号途径的“交流”互作机制以及建立针对该些病原感染的免疫防控策略具有重要价值。