多烯聚酮细胞色素P450的区域及立体特异性研究

Polyene polyketides are widely used antifungal medications with severe adverse effects. Considerable efforts has been devoted to develop derivatives that exhibit less toxicity. Regio- and stereospecific hydroxylations catalyzed by cytochrome P450s (CYPs) are among the most popular post-PKS modifications in polyene polyketide biosynthesis and affect the bioactivity significantly. Structural and functional assays of CYPs from various biosynthetic pathways have revealed that the binding mode of a substrate at the catalytic site defines the regio- and stereospecificity of a hydroxylation reaction. However, the detailed mechanism is still unclear. In this proposal, we will use a combination of approaches from structural biology, biochemistry, molecular biology, and protein engineering to elucidate the molecular basis of the regio- and stereospecificity of CYPs from polyene polyketides. Special emphasis will be placed on 1) solving the crystal structures of CYP complexed with substrate by X-ray crystallography to identify key residues in catalytic site that affect substrate binding mode; 2）elucidating the effects of these key residues on substrate binding mode by site-directed mutagenesis and in vitro functional assays; and 3) engineering the regio- and stereospecificity of CYPs rationally with the resulting information to set the stage for the utilization of CYPs in structural modification of polyene polyketides.

多烯聚酮是重要的抗真菌感染药物，但毒副作用较大，通过结构修饰降低其毒性是长期以来的重要研究目标。生物合成研究发现，细胞色素P450（cytochrome P450，CYP）催化的区域及立体特异性羟化是最常见的聚酮后修饰之一，对多烯聚酮的生物活性有重要影响。虽然多个不同生物合成途经CYP的结构功能分析都表明底物在催化中心的结合模式决定了氧化反应的区域及立体特异性，但详细的机制并不清楚。本项目中，我们将综合利用结构生物学、生物化学、分子生物学以及蛋白质工程的研究手段对CYP区域及立体特异性的分子机制进行系统探索：利用X 射线晶体衍射技术解析酶与底物复合物的三维结构，确定影响底物结合模式的关键位点；利用定点突变和体外功能分析验证其对底物结合模式的影响；最后以上述晶体结构和体外功能分析的结果为基础，尝试对CYP进行理性设计，改变其区域或立体特异性，为CYP在多烯聚酮结构改造中的应用奠定基础。

聚酮类化合物中的多烯聚酮是重要的抗真菌感染药物，但毒副作用较大，通过结构修饰降低其毒性是长期以来的重要研究目标。聚酮后修饰酶催化的立体特异性对多烯聚酮的生物活性有重要影响。虽然多个不同生物合成途经后修饰酶的结构功能分析都表明底物在催化中心的结合模式决定了氧化还原反应的区域及立体特异性，但详细的机制并不清楚本项目中，我们将综合利用结构生物学、生物化学、分子生物学以及蛋白质工程的研究手段对区域及立体特异性的分子机制进行系统探索：利用X 射线晶体衍射技术解析酶与底物复合物的三维结构，确定影响底物结合模式的关键位点；利用定点突变和体外功能分析验证其对底物结合模式的影响；最后以上述晶体结构和体外功能分析的结果为基础进行理性设计，改变立体特异性，为多烯聚酮结构改造中的应用奠定基础。. 本项目解析了阿维菌素酰基转移酶AveAT0的晶体结构，确定其催化关键性氨基酸；对聚酮后修饰酮还原酶DnrU和MeiF结构与功能研究，通过定点突变确定了DnrU四个催化关键性氨基酸，解析了MeiF的晶体结构并分析了其底物特异性，对芳香酮表现出很强催化活性；提出利用手性气相色谱/质谱（GC / MS）方法研究ER的立体定向性；对Bacillaene 酮还原酶结构域进行了异源表达及底物特异性分析，BacKR1可以还原环己酮和对氯苯乙酮，有一定的底物宽泛性，表明酮还原酶结构域具有作为生物催化剂合成手性醇的潜力；对热稳定酯酰辅酶A合成酶的异源表达及酶学特性研究，该酶具有较好的底物宽泛性，可识别丙酸、丁酸、2-甲基丙酸、戊酸、3-甲基丁酸、2-甲基丁酸以及环己甲酸等一系列单酸。反应最适温度为30 °C，最适pH为7.0。70 °C保温8 h后仍有45%的活性残留，表明该酶相对比较稳定。通过活性中心3个位点的定点突变可以改变酶的底物特异性。C. owensensis OL来源的酯酰辅酶A合成酶是潜在的生物催化剂，可以用于聚酮前体的合成。