miRNA-23a对EGFRvⅢ-CAR-T细胞抗胶质母细胞瘤功能的调节作用及分子机制的研究

Chimeric antigen T-cell receptors (CARs) marry the antibody variable region and T-cell signaling moieties to confer T-cell activation with the targeting specificity of an antibody. Clinical trials have revealed the remarkable potential of CARs in targeting a variety of antigens and cancers. Human T cells from patients with GBM transfected with EGFRvIII CARs produce Th1 cytokines and lyse tumor cells in an antigen-specific manner.. They also significantly enhance survival in mice bearing established and aggressive human xenografts. Despite their potency, in our preliminary studies, the efficacy of EGFRvIII CAR cells remains limited due to the immunosuppressive microenvironment within GBM. We identified miR-23a as a key inhibitor of CTL effector functions and anti-tumor responses in vitro and in vivo. Importantly, we have demonstrated that TGF-β signaling achieves immune-evasion, in part by up-regulating miR-23a expression in CTLs. Our HYPOTHESIS is that inhibition of miR-23a in CAR transduced effectors will confer resistance to TGF-β-mediated immunosuppression while increasing cytotoxic effector molecules to enhance anti-tumor efficacy against EGFRvIII+ GBM. Our GOAL is to enhance the efficacy of tumor-specific EGFRvIII-CARs through miR-23a-decoy.

EGFRvⅢ-CAR-T细胞治疗是胶质母细胞瘤（GBM）免疫治疗研究领域的热点问题。GBM肿瘤免疫抑制环境是影响EGFRvⅢ-CAR-T细胞临床疗效的重大障碍。CAR-T细胞肿瘤免疫抑制形成机制的阐明，是改造CAR-T细胞建立高效能抵抗肿瘤免疫抑制环境的CAR-T细胞的重要基础。我们发现TGF-β/miRNA-23a/blimp-1通路是肿瘤组织抑制CTL功能的重要途径，而下调EGFRvⅢ-CAR-T细胞中miRNA-23a功能显著增强其体外抗肿瘤免疫应答。因此，我们推测：miRNA-23a是GBM肿瘤组织中EGFRvⅢ-CAR-T细胞免疫抑制形成的关键分子。本课题将明确miRNA-23a在EGFRvⅢ-CAR-T细胞肿瘤免疫抑制形成中的作用及机制，为增强EGFRvⅢ-CAR-T细胞临床疗效提供崭新的miRNA改造靶点并拓宽我们关于CAR-T细胞活化、肿瘤杀伤分子机制的认识。

本课题在2016年开始展开为期三年的研究工作，计划明确miR-23a对EGFRvⅢ-CAR-T细胞对胶质母细胞瘤（GBM））的抑制作用和分子机制。研究工作进行中，我们建立的GBM颅内模型一直存在严重的问题,同时在与杜克大学免疫学系实验室的合作中发现敲除miRNA-23a基因小鼠T细胞来源的CAR-T细胞颗粒酶B、γ干扰素的表达以及体外杀伤实验结果与野生型EGFRvⅢ-CAR-T细胞并无显著性差别。因此，我们认为在CAR-T细胞中阻止miR-23a的表达并不能促进其活化、杀伤能力。鉴于上述体外实验结果，我们对项目的研究内容和目标进行了合理改动，并获得了部分研究成果: （1）利用逆转录病毒系统制备小鼠CD19-CAR-T细胞，通过体内外实验证明CD19-CAR-T细胞具有高效的肿瘤杀伤能力。（2）利用低频聚焦超声（FUS）联合微泡技术开放小鼠血脑屏障，促进了生物染色剂浸润脑组织，同时促使外源的淋巴细胞通过血脑屏障进入脑组织，为探寻新型的CAR-T细胞治疗中枢神经性脑肿瘤的给药途径和方式提供新思路和实验基础。（3）利用PBAE polymer包裹DNA形成稳定的纳米颗粒转染BOSC细胞表达绿色荧光蛋白（GFP），为利用该纳米颗粒转染T细胞制备初始细胞来源的CAR-T细胞提供实验基础。