黄瓜花叶病毒2a复制酶与豆科植物抗病蛋白RT4-4在过敏反应中的互作分子机制研究

研究抗病蛋白与Avr蛋白的互作是了解病原物如何被抗病蛋白所识别并进而诱导抗病反应的重要途径，本项目拟在原有黄瓜花叶病毒（CMV）诱导豆科植物发生过敏反应（HR）的基础之上，开展CMV 2a复制酶与菜豆抗病蛋白RT4-4的互作分子机制研究，明确RT4-4与2a复制酶是一种直接的还是间接的互作，鉴定直接互作中RT4-4与2a复制酶的互作结构域，或筛选间接互作中2a复制酶诱导HR反应的寄主靶蛋白，了解RT4-4分子内结构域互作及其在识别2a蛋白中作用，明确RT4-4与2a复制酶的细胞定位，鉴定其是否必需进入细胞核才能诱导HR反应。项目的完成可望较全面的反映RT4-4与CMV 2a复制酶的互作分子机理，为CMV诱导豆科植物过敏反应的机制提供理论基础，同时验证当前抗病蛋白与Avr蛋白互作工作模式的合理性及该工作模式是否具有普适性，对于进一步认识抗病蛋白与Avr蛋白的互作机制有着重要的科学意义。

黄瓜花叶病毒(CMV)可以在豆科植物上诱导局部的过敏反应（HR），之前通过CMV侵染性克隆交换研究表明CMV 2a蛋白对于在豆科植物上诱导HR具有重要作用。本课题的的通过植物表达载体单独表达CMV编码的所有蛋白，发现只有2a复制酶蛋白能够诱导豇豆产生HR，而CMV编码的其他蛋白则不能诱导HR反应。将2a进行单位点F631突变成Y就不再诱导坏死反应，而把2a另一个位点A641突变成S后却仍然可以诱导过敏反应；同时将两个位点突变后F631Y&A641S，则不再诱导豇豆产生HR；此外，我们发现三个突变体的复制能力和野生型相当。将2a蛋白与复制相关高度保守的GDD区域610位点D突变成A后， D610A突变体丧失了复制酶活性，但是，该突变体依然可以在豇豆上诱导产生HR。将GDD突变体进行缺失突变：2a301-778aa依然具有GDD突变体诱导HR的活力。我们的研究表明CMV2a蛋白单独就足以在豇豆上诱导HR，但这一功能与2a的复制酶活性是独立平行的。