生物因子诱导柑桔抗黄龙病的免疫防御分子机制的研究

Huanglongbing(HLB) disease is a destructive disease and caused serious damage in citrus production. Huanglongbing is failed to be eradicated effectively so far. After treatment with bacillus and polypeptide synergistically in HLB-infected plants, the effective disease resistance effect was performed in the early stage of this study, the transcriptome results in plant-pathogen interaction are used for the entry point. In this project, two important issues about pathogen associated molecular patterns(PAMP)-triggered immunity(PTI) and effector-triggered immunity(ETI) will be studied. ①In the reaction of PTI, high-throughput analysis of protein interactions with Co-IP/LC-MS will be performed, to clarify the protein interaction among PAMP, recognition receptors and receptor kinase; To analyze the characteristic of the kinase phosphorylation by protein post-translational modification(PTM);②In the reaction of ETI, Pull-down will be used for parsing the interaction between effector protein and host membrane protein, the host membrane protein and the resist protein; To clarify the key effect loci in the resist protein, via the preparation of the crystal and complex crystals. Surface plasmon resonance systems(SPR) and Western blot will be used for the validation of proteins interaction. The dynamic proteins interactions will be observed by fluorescence lifetime microscopy system(FLIM), thus, to reveal the molecular mechanism of innate immune induced by biological factor in host against the Huanglongbing disease.

黄龙病是柑桔毁灭性病害，给柑桔生产造成了严重损失。迄今为止，还没有一种可彻底根除黄龙病的有效方法。本项目在前期用芽孢杆菌和多肽协同处理感病植株获得良好抗病效果的基础上，以转录组中植-病互作差异表达基因为出发点，从病原相关分子模式触发免疫（PTI）和效应蛋白触发的免疫（ETI）二个方面研究蛋白的互作关系。在PTI路径中，通过Co-IP/LC-MS的蛋白质互作高通量分析，证明微生物相关分子模式与识别受体和受体激酶的互作机制；利用蛋白质翻译后修饰，分析激酶的磷酸化特征。在ETI过程中，利用Pull-down阐明效应蛋白与膜蛋白、膜蛋白与抗病蛋白的直接互作关系，并通过抗病蛋白的晶体制备，解析关键的作用位点。利用SPR和Western blot验证关键蛋白的互作。利用FLIM系统进行互作蛋白动态观察，从而揭示生物因子诱导宿主抗黄龙病的天然免疫的分子机制，为开发新型抗黄龙病的生防制剂提供理论依据。

RIN4是重要的免疫调节因子。课题组前期研究发现GJ1和PGA协同作用下黄龙病病原滴度下降，抗性蛋白RPS2基因明显上调。但与RPS2基因紧密相连的RIN4通过什么路径激发超敏感性反应和防卫相关的基因诱导尚未见报道。在基金的支持下，课题组开展了挖掘柑橘中与RIN4和RIN4-like互作蛋白的探索，利用Pull down和IC-MS/MS分别捕获到51和21个结合蛋白（置信度Unused≥4），获得了这些结合蛋白的KEGG通路；采用Pull down、WB及生物膜干涉技术（BLI）对RIN4和4个结合蛋白进行了互作验证，结果表明，RIN4与谷氨酸-tRNA合成酶具有密切的关系；还利用免疫诱导剂A处理柑桔植株，分析与RIN4互作的12个蛋白的mRNA相对表达量，其中11个基因相对表达量在48h显著上调。上述研究为阐明柑橘免疫调节因子RIN4的功能提供了重要资料，也为免疫诱导剂的挖掘提供了新思路。另一方面，利用纳米孔单分子实时电信号测序技术阐明了GJ1菌株的分类地位；比较了韧皮部杆菌、GJ1菌株和假单孢杆菌的鞭毛蛋白（flag22）分别诱导柑桔活性氧爆发的差异，结果表明韧皮部杆菌flag22激发氧爆发的水平最低，证明黄龙病病原天然激发柑橘免疫能力低；利用GJ1处理柑桔感病苗木，分析差异表达磷酸化肽段对应蛋白质的富集规律，结果磷酸戊糖途径和光合生物固碳途径被富集；对4个上调光合作用基因进行亚细胞定位和对应蛋白的PRM验证，结果转录组差异基因上调与对应的蛋白质上调表达呈正相关；分析了GJ1处理后抗性相关基因表达量及GJ1鞭毛蛋白flag22处理后谷胱甘肽酶和胼胝质含量变化；对GJ1灌根处理及对照样品进行了转录组差异基因、200代谢物和植物激素含量的分析，揭示了GJ1提高柑橘黄龙病抗病性的机理。上述研究对促进抗黄龙病新型生防制剂和免疫诱导剂的研发，具有重要的理论价值和现实意义。