基于黄豆苷元还原酶蛋白质工程改造的雌马酚生物转化体系的优化

Among soy isoflavones and its metabolites, equol draws much attention due to the superior biological activity and in vivo stability. Biotransformation has been considered as a promising means for large-scale preparation of equol. The existing equol biotransformation pathway has a redundant pathway and the high concentration of the final product equol feedback inhibits the activity of daidzein reductase (DZNR), which limit the efficient large-scale preparation of equol. Therefore, this project intends to modify DZNR which was a key enzyme in the biotransformation of daidzein to equol by protein engineering. The DZNR mutants activity will be screened based on whole cell equol biotransformation capacity by semi-rational design combined with directed evolution. The final screened mutants would have the ability to catalyze daidzein to produce a reversal configuration (R→S) product and release from the inhibition of high equol concentration. Thereby a simplified equol biotransformation pathway will be constructed. The transformation system will be further optimized, aiming at constructing a recombinant strain for the green and efficiency equol production. The project laid a solid foundation for the industrial green preparation of the food functional ingredient equol.

在大豆异黄酮及其众多代谢产物中，雌马酚显示出更加优越的生物活性和体内稳定性而备受关注，生物转化法是目前最具开发潜质的大规模制备雌马酚的方法。现有的雌马酚生物转化途径中存在冗余途径及高浓度终产物雌马酚反馈抑制黄豆苷元还原酶（DZNR）活性等问题，上述因素限制了雌马酚的高效规模化制备。因此，本项目拟通过对黄豆苷元到雌马酚生物转化途径中的关键酶DZNR进行蛋白质工程改造，通过半理性设计结合定向进化的方法构建DZNR突变体库，并基于全细胞DZNR活性进行突变体筛选，筛选出催化产物构型得到反转（R→S）并解除高浓度雌马酚抑制的DZNR突变体，从而构建出途径简化的雌马酚生物转化体系。进一步对转化体系进行条件优化，旨在构建途径优化的雌马酚重组转化菌株，实现雌马酚高效绿色制备。本研究为食品功能性成分雌马酚的绿色规模化制备奠定基础。

在大豆异黄酮及其众多代谢产物中，雌马酚显示出更加优越的生物活性和体内稳定性而备受关注，雌马酚的制备方法主要有化学合成法、天然雌马酚产生菌发酵制备法和工程菌株生物转化制备法，目前利用合成生物学法及代谢工程技术进行雌马酚的生物转化制备是该领域内的研究热点之一。本研究首先对重组大肠杆菌进行体系优化，构建了包含有雌马酚生物转化途径4个酶和1个提供途径中还原力再生的葡萄糖脱氢酶的重组大肠杆菌。利用构建的重组大肠杆菌BL21(DE3)-pCDFDuet-dznr-dhdr-thdr-ddrc-gdh进行雌马酚的生物转化制备，探索了雌马酚全细胞转化的最适条件，当pH值为8.0，温度为32 ℃，葡萄糖浓度为4%（g/V），底物浓度为1mM时，全细胞对底物黄豆苷元能够保持高效的转化，转化体系中3h达平衡，在100 mL转化体系中雌马酚最终产量达到223.6 mg/mL。此外，本研究对雌马酚生物转化途径中的关键酶——黄豆苷元还原酶（DZNR）开展了蛋白质结构预测分析及蛋白质工程改造的研究，通过预测DZNR的三维结构，并将其与底物分子进行对接分析，发现DZNR中的Gly30和Ala105可能在酶催化中发挥重要作用；进一步通过开展蛋白质改构研究，选取关键位点30、72、74 、105、174位点进行定点突变或半饱和突变研究，发现当位点30、72、174突变为丙氨酸后，酶活性大幅度下降，说明这些位点对酶活性的发挥起到重要作用，推测该位点可能参与底物的催化或结合。本研究的开展为黄豆苷元还原酶的结构与功能研究提供重要参考，为今后进行雌马酚生物转化的进一步优化及大规模制备奠定了基础。