垂体及下丘脑Ⅱ型脱碘酶泛素化修饰在慢性碘过量致TSH升高中的作用及机制研究

Epidemiological investigation indicated that prolonged high iodine intake would lead to elevation of serum TSH level, but the mechanism is elusive. Type 2 iodothyronine deiodinase(D2) plays a crucial role in hypothalamic-pituitary-thyroid axis, and its varying of activity could lead to changing of TSH. Our previous animal experiments have proved that activity of D2 is surpressed and TSH level increases in Wistar rats fed with long-term high iodine. Based on these data, we further explore the case of that long-term high iodine lead to activity of D2 surpressed. We hypothesis that chronic iodine overdose would change key enzyme of D2 ubiquitin-proteasome pathway→increase ubiqutination of D2 in pituitary/hypothalamus→activity of D2 decreases→conversion rate of T4 to T3 decreases and T3 decreases→the supression effect on TSH/TRH decreases→TSH increases. Our study aims to eluminate the effect of iodine on D2 ubiquitination after we had sucessfully built the iodine induced TSH elevation rat model and its potential mechanism acording to co-immunoprecipitation, immunofluorescence and so on, besides, some in vitro expriments would be processed in order to further clarify its mechamism. Acording to the different levers of body, tissue, cell and molecule, we would explore the mechanism that iodine induces TSH elevation, providing theoretical basis for the iodine suppliment policy making.

流行病学调查发现TSH水平随碘摄入量的增加而升高，但是机制尚不明确。Ⅱ型脱碘酶（D2）在下丘脑-垂体-甲状腺轴中起着至关重要的作用，其活性的变化会导致TSH的改变。本课题组前期动物实验发现：慢性碘过量大鼠模型中TSH升高，垂体D2活性下降。在此基础上，本课题组将进一步探究慢性碘过量导致D2活性降低的原因。我们提出假说：慢性碘过量使D2泛素-蛋白酶体通路的关键酶变化→垂体/下丘脑中D2脱碘酶的泛素化增强→D2活性减弱→T4向T3的转化率下降、T3减少→对TSH/TRH的抑制作用减弱→TSH升高。本课题组利用已建立的慢性碘过量大鼠模型，采用免疫共沉淀，双分子荧光等实验方法探究慢性碘过量对D2泛素化通路的影响，同时在体外细胞实验中予以碘和T4干预，进一步探讨碘在D2的泛素化中的作用机制。通过从整体、组织、细胞和分子不同层面探讨慢性碘过量致TSH升高的机制，为制定合理安全的碘摄入量提供科学依据。

流行病学调查发现TSH水平随碘摄入量的增加而升高，但是机制尚不明确。Ⅱ型脱碘酶（D2）在下丘脑-垂体-甲状腺轴中起着至关重要的作用，其活性的变化会导致TSH的改变。本课题组前期动物实验发现慢性碘过量大鼠模型中TSH升高，垂体D2活性下降。在此基础上进一步探究慢性碘过量导致D2活性降低的原因。Wistar大鼠正常饮食加不同浓度高碘水喂养4周，8周，12周，24周。使用化学发光酶免疫分析方法检测血清TSH，T3，T4；检测垂体TSHβ的表达量。Wistar大鼠垂体、下丘脑、使用蛋白免疫印迹方法（WB）检测D2，Ub-D2含量；提取总RNA，反转录为cDNA，通过PCR检测D2 mRNA的表达。确定在慢性碘过量大鼠D2转录后泛素化修饰的存在。使用PCR，WB对D2特异性泛素连接酶WSB-1，TEB-4，特异性去泛素化酶USP20，USP33的mRNA及蛋白水平进行检测。检测TEB-4的特异性去泛素化酶USP19的表达。通过使用内源及外源表达D2的细胞系进行高碘干预，检测D2的泛素化通路。垂体TSHβ随摄碘量升高及摄碘时间的延长而表达增加；Wistar大鼠垂体D2蛋白表达降低（P<0.05），mRNA表达不降低；垂体D2特异泛素连接酶WSB1的基因和蛋白表达增多；垂体D2特异泛素连接酶TEB4表达增多。TEB4蛋白在24w的10HI组增加1.4倍。冰冻切片的免疫组化染色结果显示，在各个时间点各高碘组大鼠下丘脑D2蛋白表达水平较对照组均有所增加。细胞学实验的结果显示随着碘浓度的增加和干预时间的延长D2蛋白表达逐渐减低，mRNA水平无变化。随着碘浓度的增加和干预时间的延长D2特异泛素连接酶WSB1、TEB4蛋白表达逐渐增加，mRNA水平无变化。随着碘浓度的增加和干预时间的延长D2去泛素化酶USP20和USP33表达逐渐减低。随着碘浓度的增加和干预时间的延长TEB-4 的特异性去泛素化酶USP19无变化。慢性碘过量使D2泛素- 蛋白酶体通路的关键酶变化→垂体D2的泛素化增强→D2活性减弱→T4向T3 的转化率下降、T3减少→T3对TSH合成的抑制作用减弱→TSH 升高。本研究阐明了慢性碘过量引起血清TSH变化的可能机制，解释了本研究组大型流行病学调查发现的现象。本研究与流行病学调查结果相结合，为我国碘盐的科学管理，以及因地制宜地补碘等方面提出了充实的理论依据.