紫外诱导桑叶中Diels-Alderase合酶的分离纯化及其结构研究

The Diels-Alder type adducts involved in Cortex Mori have significant anti-inflammatory and anti-tumor activities. However, the content of Diels-Alder adducts is low, which limits the further study. The content of Diels-Alder adducts was increased by using UV-B induced method. Diels-Alderase is the key enzyme in the biosynthetic pathway of Diels-Alder adducts. Until now, there is no report on the Diels-Alderase in plants. Additionally, the crude enzyme of UV-B induced mulberry leaf could catalyze the synthesis of D-A adducts, which established the foundation for follow-up study.. In the present, we focused on the study of Diels-Alderase enzyme and try to separate and purify the Diels-Alderase from the crude enzyme of mulberry leaf using multistep column chromatography method and enzyme activity as a monitoring method. Finally, we obtained the high purity of Diels-Alderase and analyze its amino acid sequences. The enzyme activity was verified by heterologous expression. Through the optimization of protein crystallization conditions, the three-dimensional structure of Diels-Alderase was analyzed using cryo-EM technique. It will reveal the biocatalytic mechanism of Diels-Alderase in Morus. Also, the present study will promote the study on key enzymes involved in the biosynthetic pathway of active ingredient in traditional Chinese medicine.

中药桑白皮特有的Diels-Alder（D-A）型加合物具有显著的抗炎和抗肿瘤的生物活性，但含量很低，限制了研究与开发。前期运用紫外诱导的方法，使桑叶生成了足够的D-A型加合物。Diels-Alderase合酶是D-A型加合物生物合成的关键酶，在植物中还没有Diels-Alderase合酶的报道，桑叶粗酶能高效地催化D-A型加合物的生成，为Diels-Alderase合酶的研究奠定了基础。. 本课题进一步研究Diels-Alderase合酶，拟通过多步柱层析分离，特异性酶活跟踪监测，优化紫外诱导桑叶Diels-Alderase合酶的纯化条件，得到高纯度的Diels-Alderase合酶，测定其氨基酸序列；通过酵母异源表达验证后，优化蛋白结晶条件，运用低温电子显微镜解析其三维结构，阐明Diels-Alderase合酶的催化机理。本课题促进了中药有效成分生物合成关键酶的研究。

中药桑白皮特有的Diels-Alder（D-A）型加合物具有显著的抗炎和抗肿瘤的生物活性，但其含量很低，限制了研究与开发。在国家自然科学基金资助下，我们应用紫外诱导技术，使得桑叶中生成了大量的D-A型加合物。Diels-Alderase合酶是D-A型加合物生物合成的关键酶，在植物中还没有被报道。为了进一步阐明桑叶中D-A型加合物生物合成机制，我们采用酶活监测结合蛋白纯化的方法对桑叶中Diels-Alderase合酶进行分离纯化及功能验证。研究过程中由于其它研究组抢先报道了桑树中的Diels-Alderase合酶，我们进一步对D-A型加合物完整生物合成途径中桑辛素特异性异戊烯基转移酶进行了基因挖掘及功能验证。首先通过比较白桑不同组织部位和不同处理叶片的差异转录组，进而从基因层面阐释D-A加合物生物合成途径中的关键基因，而且体外粗酶活性测定也发现桑辛素M的关键前体物是氧化白藜芦醇，由MMS酶参与催化。通过转录组学数据分析，我们发现了2564个unigenes可能为潜在的参与调控D-A型加合物途径的转录因子，其中注释到MYB家族的占8%，AP2/ERF家族的占7%，C2H2家族和bHLH家族的各占5%，WRKY家族、GRAS家族以及C2C2家族的各占4%。最终我们推测与其他植物不同，在白桑中C2‘H可以催化香豆酰辅酶A生成2‘-羟基对香豆酰辅酶A，进而在STS、CHS和CHR/CHS的催化下生成具有2‘-羟基的特征性二苯乙烯、黄酮和脱氧查尔酮。这些产物继而在MMS、PT等酶的作用下产生D-A型加合物的前体。利用川桑和白桑的基因组数据，我们鉴定了24条编码的PT基因序列，并将其氨基酸序列与已经报道的MaIDT和MaOGT进行系统进化分析。此外，为了进一步研究PT催化桑树中桑辛素M不同位点异戊烯基化反应的机制，我们应用了AlphaFold2预测了蛋白结构，并用Autodock vina进行分子对接模拟，结果表明桑辛素M与MaPT6的Tyr126和Asn169侧链产生氢键作用从而固定受体底物。本课题对桑叶中的有效成分D-A型加合物的生物合成途径进行了解析，并对途径中2个关键酶进行了体外的功能表征，为将来应用生物合成的方式生产有效成分提供了技术手段。