基于紫外诱导圆锥铁线莲叶绿体内抗肿瘤香豆素生物合成关键酶与关键基因的研究

As an abiotic stress factor, ultraviolet can induce plants to produce secondary metabolites with important biological activity. Funded by the National Natural Science Foundation, our preliminary studies have shown that UV can induce Clematis terniflora DC. leaves to produce linear pyrano-coumarins which have significant anti-tumor activity. Through comparative proteomics analysis, we have found a number of enzymes related to coumarin biosynthesis. Therefore we can determine the chloroplast to be the major organelle for coumarin biological synthesis by HPLC. Biosynthetic mechanism of coumarin on the subcellular level has not been reported yet. .This project intends to use two-dimensional electrophoresis to carry out comparative proteomics study of UV-induced Clematis terniflora DC. chloroplast, and also use Second-generation high-throughput sequencing technology to study the transcriptome. Through fitting analysis between different expressed proteins and different expressing genes, we could find key enzymes closely related to the UV stress and coumarin biosynthesis, and then validate by RT-qPCR. We also carried out the study of antitumor activity of UV-induced coumarin in vitro. This subject will reveal the mechanism of plant responsing to UV stress and secondary metabolite biosynthesis, and also provide new research methods to find secondary metabolitess with important biological activity, and improve the quality of herbs.

紫外诱导可以促使药用植物产生具有重要生物活性的化合物，在国家自然科学基金资助下，我们应用紫外诱导技术，使圆锥铁线莲叶片产生了3种具有显著抗肿瘤活性的香豆素类化合物；运用差异蛋白质组学技术，发现了若干与香豆素生物合成相关的酶；通过梯度离心和HPLC检测相结合，推测叶绿体为香豆素生物合成的主要场所，关于亚细胞水平香豆素的生物合成机理未见报道。.本课题拟采用双向电泳技术，进行紫外诱导前后圆锥铁线莲叶绿体差异蛋白质组学研究；采用二代高通量测序技术对诱导前后圆锥铁线莲叶片转录组进行研究；通过差异蛋白与转录组差异表达基因间的相互匹配分析，寻找圆锥铁线莲响应紫外诱导以及调控香豆素生物合成的关键酶与关键基因，并通过RT-qPCR加以验证；同时进一步对香豆素体外抗肿瘤活性进行研究。本课题将为深入分析中药和天然药物活性成分生物合成的关键酶和关键基因奠定基础，也为提升药材质量、发现新颖的活性成分提供技术手段。

紫外诱导可以促使药用植物产生具有重要生物活性的化合物，在国家自然科学基金资助下，我们应用紫外诱导技术，使圆锥铁线莲叶片产生了3种具有显著抗肿瘤活性的香豆素类化合物。为了阐明紫外辐射诱导圆锥铁线莲叶片内代谢扰动而激活的3个香豆素的生物合成途径，我们从系统生物学的角度出发，分别应用代谢组学、转录组学和蛋白质组学技术，对圆锥铁线莲叶片应用高强度UV-B诱导和黑暗培养的响应机制进行了研究。代谢组研究发现紫外诱导后的黑暗培养阶段，有38个次生代谢物含量发生了显著的变化，其中有19个次生代谢物为响应胁迫处理特异合性成，显示黑暗培养导致圆锥铁线莲叶片内发生了更加剧烈的扰动。这些代谢物主要属于脂肪酸类，内酯类，多酚类，苯甲酸类，香豆素类以及芪类。我们对高强度UV-B诱导前后以及黑暗培养后的转录组表达谱进行了分析，结果显示次生代谢途径相关的Unigene数量在诱导及避光培养阶段依次上升。针对转录本表达谱中所涉及的次生代谢信息进行了深入研究发现包含Unigene最多的次生代谢途径为苯丙烷类，二苯乙烯类，黄酮和黄酮醇，莨菪烷类和异喹啉生物碱类。其中在苯丙烷代谢途径中，有54.4%的unigene在高强度UV-B诱导阶段上调表达，而在高强度UV-B诱导后的黑暗培养阶段有58.3%的unigene发生了上调表达，表明苯丙烷类代谢途径积极响应了高强度UV-B诱导和随后的黑暗培养胁迫。通过整合代谢组学和蛋白质组学数据，结果发现氨基酸代谢相关的代谢物的含量和蛋白质丰度在响应高强度UV-B诱导和黑暗培养阶段显著增加。通过对转录组和蛋白质组数据进行整合分析，发现圆锥铁线莲叶片逆境耐受性因三羧酸循环途径的激活而显著增强。应用qRT-PCR，酶学活性实验，结合NMR和LC-MSMS等技术，最终确定了多酚氧化酶（PPO）和咖啡酸为香豆素合成的关键酶及关键底物，并合理推测出了复杂香豆素的合成途径。本课题为深入分析中药和天然药物活性成分生物合成的关键酶和关键基因奠定基础，也为提升药材质量、发现新颖的活性成分提供技术手段。