1,5-戊二醇非天然合成途径的从头设计与机理研究

Design and construction of non-natural pathways are important for expanding the capacity of cells to produce value-added products. 1,5-Pentanediol (1,5-PDO) is an important diol which is used as a monomer for the synthesis of polyester and polyurethane. 1,5-PDO is a non-natural metabolite which is currently produced exclusively by chemical approaches. In this project, we design and analysis several non-natural pathways for the biosynthesis of 1,5-PDO and implement one of the most promising pathways in a lysine-producing Corynebacterium glutamicum strain. This pathway utilizes seven biochemical reactions to transfer lysine into 1,5-PDO, including three modules, namely 5-aminopentanoate synthesis module, 5-hydroxyvalerate synthesis module, and 1,5-PDO synthesis module. Metabolic pathway design, enzyme screening and engineering, modular pathway optimization, and systems metabolic engineering will be combined in this study to build up this new pathway and study its mechanism. This project opens a new way to biologically convert cheap sugars into 1,5-PDO，also building the basis for de novo pathway design for other non-natural diols.

设计与重构非天然代谢途径对于拓展细胞的代谢能力、生产具有重要附加值的非天然分子具有重要意义。1,5-戊二醇是一种重要的非天然二元醇，是合成聚脂、聚氨酯等高性能材料的重要原料，目前尚无已知的合成途径。本项目从头设计了一系列非天然的1,5-戊二醇生物合成途径，并对其中一条途径进行深入的重构与解析，以实现从简单碳源葡萄糖到1,5-戊二醇的生物合成。该途径以赖氨酸为代谢前体，通过5-氨基戊酸合成模块、5-羟基戊酸合成模块和1,5-戊二醇合成模块实现1,5-戊二醇的从头合成。本项目分别从代谢途径设计、新酶的筛选与改造、途径模块化优化、底盘微生物的系统改造四个方面进行深入研究，探索二元醇非天然生物合成途径设计的基本原则，建立高效挖掘和设计催化非天然途径中新生化反应的新酶元件的有效方法，解析新元件、新途径和底盘细胞自身代谢的相互作用与适配机制，为构建高效的1,5-戊二醇细胞工厂奠定基础。

利用合成生物学技术拓展和延伸现有的细胞代谢网络，构建非天然分子的高效生物合成新途径对于理解代谢途径的进化机制以及拓展微生物细胞工厂的应用范围具有十分重要的意义。1,5-戊二醇是一种重要的二元醇，广泛地应用于制造聚酯、聚氨酯、增塑剂、油墨和涂料等，但其缺乏天然的生物合成途径，无法利用生物法实现生物合成。本项目分别从非天然途径设计、酶的挖掘、模块优化与组装、底盘优化四个方面进行深入研究，构建可以利用廉价碳源高效合成1，5-戊二醇的细胞工厂。在途径设计方面，本项目通过代谢网络模拟设计并比较了8条不同的1,5-戊二醇生产路径的最大理论转化率和代谢通量分布，并选择2条代表性的路径进行研究。其中效率最高的一条途径仅通过在大肠杆菌中仅引入一种异源酶，可实现从中间代谢物戊二胺到1，5-戊二醇的生物转化，途径具有高的理论转化率、能量效率和催化驱动力。在酶的筛选方面，本项目通过筛选不同的脱氢酶、转氨酶、羧酸还原酶等来构建高效的1,5-戊二醇合成模块和5-羟基戊酸合成模块，获得了高效率的人工途径。在优化发酵条件方面，通过优化发酵所需的诱导剂浓度和诱导时间，减少中间产物戊二胺的积累，提高菌株的耗糖速率和1,5-戊二醇产量。在底盘优化方面，通过敲除副产物合成路径，促进谷氨酸的循环等方式提高了流向1,5-戊二醇合成路径的代谢通量。构建的菌株能够利用葡萄糖为唯一碳源生产1,5-戊二醇，产量达到9.25g/L, 摩尔得率为0.28mol/mol 葡萄糖。本项目开发的方法对其他二元醇的非天然生物合成路径的从头设计与构建具有重要的指导意义。