全细胞催化合成1,5-戊二胺过程的物质跨膜转运机制及调控研究

The catalytic efficiency of whole cell biocatalyst is depended critically on transmembrane transport efficiencies of substrate/product across membrane barriers. Although the efflux of cadaverine can be enhanced through regulation of specific antiporter, an energy-dependent active efflux system is needed to improve the cadaverine transport against the concentration gradient, due to the fact that the cadaverine has a higher extracellular than intracellular concentration. However, the mechanisms of transmembrane transport and energy synthesis involved in whole cell biocatalysis were still not clear, which result in a lack of regulation strategies. This study aims to elucidate the mechanism of transmembrane transport of cadaverine, and hence regulating the process. The mechanism of transmembrane transport of substrate/product, proton and relative ions, in resting cells, membrane vesicles and proteoliposomes will be studied, and the correlation among chemicals transmembrane transport, proton motive force changes and ATP consumption will be investigated. The energy sources used and the mechanism of energy synthesis for product efflux against the concentration gradient will be identified, and the proteins involved in biological transport and energy synthesis will be elucidated. A model for cadaverine transmembrane transport and relative energy synthesis will be proposed, and the chemicals transport will be regulated by modification of proteins accordingly, which can provide theoretical support for production of bio-based chemicals by using whole cell biocatalysts.

细胞膜作为天然屏障使全细胞催化效率受限于底物/产物的跨膜转运效率。在全细胞催化合成戊二胺过程中，虽然戊二胺的跨膜外排效率可通过特异性的双向转运蛋白得以加强，但由于戊二胺的胞外浓度远高于胞内，因此要进一步提高逆浓度梯度外排还需要能量依赖的主动运输系统。然而，目前对戊二胺在细胞中的物质转运及能量合成机制还缺乏认识，难以实现调控。本项目以解析戊二胺跨膜转运机制，并实现戊二胺转运调控为目标，通过研究静息细胞、膜囊泡和蛋白脂质体三个水平的底物/产物、质子及相关离子的跨膜转运机理，确立物质转运过程与质子动力势变化和ATP消耗间的关系，确定产物逆浓度梯度转运的能量来源及合成机理，探究在全细胞催化合成戊二胺过程中与物质转运和能量合成相关的蛋白组成，建立戊二胺跨膜转运及能量合成与调控模型，并通过相关蛋白质改造实现对催化过程中戊二胺跨膜转运调控。本项目可为全细胞催化合成化学品的物质跨膜转运调控提供理论支撑。

本课题以1,5-戊二胺快速合成期间的静息细胞膜两侧质子动力势的变化研究为中心，对全细胞催化过程中物质跨膜转运及能量供给机制进行研究，建立1,5-戊二胺全细胞催化过程中物质的跨膜转运模型，实现了对1,5-戊二胺的全细胞催化过程的人为调控，并将该模型应用到其他全细胞催化过程的调控。研究结果表明1,5-戊二胺的胞内合成、跨膜转运过程均不受胞内ATP含量的影响，在不同1,5-戊二胺合成速率下，静息细胞的胞内ATP变化与1,5-戊二胺合成间没有直接关联，双向转运蛋白CadB介导的L-赖氨酸/1,5-戊二胺跨膜转运与胞内ATP含量也没有相关性，但与细胞膜两侧质子动力势密切相关，表明全细胞催化合成1,5-戊二胺过程的物质跨膜转运能量来源于细胞膜两侧质子动力势的变化。研究发现随1,5-戊二胺的合成速率增加，胞内pH有一定的降低，但总体降幅较小，维持在pH 6.7左右；而胞内K+浓度与胞外1,5-戊二胺/赖氨酸浓度呈密切相关，菌体胞内K+浓度随外排1,5-戊二胺含量的增加而降低，而与胞外赖氨酸浓度呈两态性分布，当胞外赖氨酸在低浓度时(<50 g/L)，胞内K+集中在14 mM左右，当赖氨酸浓度在高浓度时(>50 g/L)，胞内K+浓度降为8 mM左右。试验建立了单位菌体1,5-戊二胺合成量与胞外赖氨酸浓度、胞内pH、胞内K+浓度的相关方程，验证实验表明模型预测值与真实值误差约为6%-10%，表明该模型可实现对1,5-戊二胺的全细胞催化过程的人为调控。此外，应用模型阐明的机理开发了戊二胺-丁二酸同步发酵生产工艺，探究了不同胞外赖氨酸浓度下1,5-戊二胺全细胞催化剂的稳定性，并拓展应用到γ-氨基丁酸的全细胞催化合成过程调控。本研究阐明了全细胞催化合成1,5-戊二胺过程物质跨膜转运的能量机制，为全细胞催化合成1,5-戊二胺的过程调控、基因工程生物催化剂的构建及全细胞催化工艺设计提供了理论指导。