小鼠脂肪间充质干细胞诱导分化为雄性生殖细胞的研究

In our previous study, mADSCs(adipose-derived mesenchymal stem cells from mouse) have been transdifferented into male germ cell in vivo when mADSCs were allogeneic transplanted in seminiferous tubuli of busulfan-treated mice. Further mADSCs were differentiated into male reproductive cells which were Vasa and c-kit positive.In this research mADSCs marked with green fluorescence will be cultured to transdifferentiate into primordial germ cell like cells (PGCLCs) with conditioned medium. The expression of related genes in PGCs, PGCLCs and mADSCs will be compared by gene chip, Real time PCR, protein hybridization, immunofluorescence technique,and finally PGCLCs will be identified. Furthermore, PGCLCs will be transplanted into the azoospermia mouse testis seminiferous tubules or cultured in three dimensional condition or co-cultured with testicular fluid in order to induce PGCLCs into the reproductive ability of male gametes, the related gene expression will be detected . The fertilization ability of induced haploid male gametes will be eveluated by in vivo fertilization and intracytoplasmic sperm injection. The results of this research would supply a new methodology for male fertility improvement and reconstruction, and establish a culture system for mesenchymal stem cells differentiation into male germ cell,and be of great significance in deeply explore spermatogenesis mechanism.It has important academic guiding sjgnificance and practical application value in the development of repruductive medicine.

前期研究中，将小鼠脂肪间充质干细胞（mADSCs）同种异体移植到无精症模型小鼠睾丸中，mADSCs转分化为表达雄性生殖细胞表面抗原Vasa和c-kit的细胞。在此基础上，本研究将绿色荧光mADSCs在条件培养基中诱导培养使其转分化为原始生殖样细胞（PGCLCs），通过基因芯片、蛋白杂交、免疫荧光化学等对PGCLCs、PGCs和mADSCs中相关基因表达进行分析，并对PGCLCs细胞进行鉴定。进一步将PGCLCs移植入无精症小鼠睾丸曲细精管中、或在体外进行三维立体培养以及与睾丸液共培养，诱导PGCLCs形成雄性配子，对减数分裂相关基因进行检测。通过卵胞浆内单精子显微注射对诱导形成的雄性配子的受精能力进行评价。本课题对雄性生育力的改善和重建提供新的方法学，对间充质干细胞转分化为雄性生殖细胞技术体系的建立以及深入探讨精子发生机理具有重要意义，对生殖医学的发展具有重要的理论指导意义和实际应用价值。

近年来由于男性因素导致的不孕症显著增加，我国每年大约有40万非梗阻性无精症患者不能生育，不能成为遗传学上的父亲，给患者造成了巨大的精神压力，严重影响了家庭幸福和社会和谐。辅助生殖技术能够使少、弱、畸形精子症患者生育，但是对于无精症患者目前尚无有效的治疗方法。干细胞转分化为雄性生殖细胞是最为有效的治疗途径，脂肪间充质干细胞因其取材容易，易于培养，体外培养增殖速度快，可来源于患者自身，在临床治疗中不存在免疫排斥及伦理道德的限制成为首选的种子细胞。在课题研究中，我们建立了GFP雄性C57小鼠脂肪间充质干细胞体外分离培养技术体系，得到能够稳定传30代以上的mADSCs，在体外培养过程中染色体数目正常，表达mADSCs特异基因，能够诱导分化为成骨、成软骨、成脂细胞；制备了无精症小鼠模型；经诱导后的mADSCs移植到无精症小鼠睾丸曲细精管中能够转分化为雄性生殖细胞。mADSCs在体外经过7种小分子化合物贯续诱导形成ips样细胞，诱导形成的细胞碱性粒氨酸酶阳性，表达20多种胚胎干细胞标记基因，经分化诱导能够形成雄性生殖细胞，表达雄性生殖细胞标记基因以及减数分裂发生特异基因。通过研究成功建立了mADSCs转分化为雄性生殖细胞的技术体系。但是没有得到完成减数分裂的单倍体细胞，也没有得到具有受精能力的雄性配子。有待于进一步的研究。与此同时，我们通过免疫磁珠分选技术获得GFP-C57精原干细胞，利用高通量测序技术对mADSCs和mSSCs进行了转录组测序和lncRNA测序。测序结果表明有1288个基因表达上调，816个基因表达下调。经过生物信息学分析：在脂肪间充质干细胞向精原干细胞转化过程中起关键作用是15个核心基因，主要与mTOR，HIF-1及PI3K-Akt信号通路有关，为mADSCs转分化为雄性生殖细胞提供了重要的理论依据。通过以上研究丰富发育生物学、生殖生理学和遗传学理论基础，而且为雄性生育力的改善和重建提供新的方法学，对于辅助生殖技术的临床应用具有非常重要的意义。