人脐带间充质干细胞来源诱导多能干细胞向男性生殖细胞诱导分化的研究

干细胞移植是治疗男性不育症的理想方法。前期研究表明，人脐带间充质干细胞（HUMSCs）具有向精原细胞诱导分化潜能，可作为细胞替代治疗男性不育症的理想供源，但目前分化的HUMSCs源精原细胞样细胞还处在精子发生的减数分裂前期阶段，如何将其进一步向成熟精子分化是突破当前HUMSCs移植治疗男性不育 "瓶颈"的重要环节。本研究拟在前期研究的基础上，将转录因子Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4中的一个或几个因子分别转染至HUMSCs，将其逆转为诱导多能干细胞（iPS细胞）后，再将HUMSCs来源的iPS细胞培养于生殖细胞条件诱导液中，使其向精原细胞诱导分化，通过对其男性生殖细胞相关基因表达的检测，探讨HUMSCs源iPS细胞向男性生殖细胞诱导分化潜能；同时将诱导后的细胞移植于不育小鼠模型体内，探讨其治疗男性不育的可能性及安全性，为HUMSCs移植治疗男性不育提供理论依据及实验基础。

建立和鉴定人脐带间充质干细胞(HuMSCs)来源的iPS，并在体外将得到的iPS细胞和HuMSCs向男性生殖细胞和胰腺前体细胞方向诱导和探讨HUMSCs恶性转化的可能性。方法 将HuMSCs重编程为iPS细胞，通过形态学、碱性磷酸酶(AKP)染色、多能性基因、细胞核型、免疫荧光、拟胚体形成、体内畸胎瘤形成实验对iPS细胞进行多能性鉴定；用化学诱导、睾丸支持细胞作为饲养层及DAZL基因感染的方法将iPS细胞及HuMSCs向男性生殖细胞方向诱导；用重编程的方法将HuMSCs向胰腺前体细胞方向诱导；用3-甲基胆蒽（MCA）处理HuMSCs，并进行裸鼠成瘤实验，观察细胞的形态和生长速度及肿瘤长出后做病理学鉴定及原代培养。结果1.iPS细胞证实为多能干细胞：形态上类似于胚胎干细胞；碱性磷酸酶表达阳性；多能性相关基因表达；细胞核型正常；表达ESCs特异性蛋白；体内分化为畸胎瘤；体外分化为拟胚体；2.iPS细胞在未分化时表达微量的生殖细胞相关基因，经BMP4诱导后， DAZL、DPPA3表达量明显升高，第10天减数分裂后期基因PRM1表达量达到最高；3.利用HuMSCs与睾丸支持细胞共培养，HuMSCs逐渐形成类似精原细胞样的圆形细胞菌落，RT-PCR、细胞免疫荧光、west blot均可以检测到诱导不同时期男性生殖细胞特异性标记VASA、DAZL及stella的表达。4. HUMSCs在感染DAZL重组腺病毒后形态发生明显变化，形成类似精原细胞样的圆形细胞和蝌蚪样的精子样细胞；RT-PCR和免疫荧光检测到精原细胞标记DDPA3,VASA, c-kit, DAZL和OCT4的表达。5.huMSCs在腺病毒携带外源基因pdx1、ngn3、mafa单独或不同组合诱导条件下，在不同时间点胰岛β细胞内源性基因表达水平存在差别；6.用MCA处理HuMSCs后，细胞的形态、生长状态和生长速度发生变化，表现出肿瘤细胞的一些特征；将此细胞注射于裸鼠皮下，约2个月后可形成包块，病理切片提示为恶性肿瘤，结合免疫组化提示为肉瘤或低分化肿瘤；肿瘤细胞常染色体显示为人源性细胞。结论　携带OCT4、SOX2、Klf4、c-myc、Nanog、Lin28六因子的慢病毒感染HuMSCs能够较高效率的获得完全重编程的iPS细胞；用化学诱导、睾丸支持细胞作为饲养层及DAZL基因感染的方法能够将iPS细胞及HuMS