miRNA在结直肠癌肝转移射频消融后残余癌早期诊治中的应用研究

Residual malignancy (RM) after radiofrequency ablation (RFA) for colorectal liver metastasis (CLM) has significant impact on cancer treatment efficacy, which can be highly improved by providing early disease management and thus extended life expectancy can be achieved. miRNAs are small non-coding regulatory RNAs which show superiority in cancer diagnosis and provide therapeutic targets for cancer treatment in recent studies. Previous literature demonstrated that miRNA had great potential for early detection of CLM, however, whether serum miRNA can be a noninvasive biomarker for RM diagnosis and prediction after RFA for CLM remains unknown.This study aims to look for new biomarkers for early RM diagnosis as well as provide therapeutic targets for cancer intervention. Analysis will be performed to identify the difference of serum miRNA between patients with and without RM. The concordance of miRNA pattern in RM tissue and serum will be tested. Target miRNA will then be selected based on the result of miRNA array analysis. Quantitative analysis for target miRNA will be carried out in extended population for evaluate its predictive ability. Finally, RNA intervention for target miRNA will be applied in vitro and in vivo to reveal possible biologic changes in RM.

残余癌严重影响射频消融治疗结直肠癌肝转移疗效，早期诊断并施以合理的治疗可大幅提高患者生存率。循环血miRNA是新近发现的内源性小分子核苷酸序列,具有分子诊断标志物优点并可提供生物治疗靶点。早期研究发现miRNA可预测结直肠癌转移的发生，而循环血miRNA是否可作为诊断及早期预测射频消融术治疗结直肠转移癌后残余癌的生物标记物尚未见报道。本项目拟用miRNA芯片比较残余癌患者与无残余癌患者血浆miRNA表达谱式，并验证残余癌组织与对应血浆miRNA模式的一致性，初步筛选在残余癌中差异表达的miRNA；针对芯片筛选结果进行芯片显著性分析和预测分析以获得与残余癌密切相关的特定miRNA；针对特定miRNA进行大样本定量验证,分析其早期预测残余癌存在的能力，为早期预测残余癌提供新的生物标记物，为早期干预残余癌提供潜在治疗靶点。

结直肠癌肝转移（CLM）是常见的肝脏恶性肿瘤之一，射频消融（RFA）术具有创伤小、安全有效等优势在临床广泛用于CLM 治疗，影响其疗效的最主要问题是肿瘤残余及复发，对残余癌早期诊断并施以合理的治疗可大幅提高患者生存率。.纳入10例结直肠癌根治术后的肝转移患者，7男、3女，年龄48～62岁。，首次消融前需穿刺活检、病理证实肝内病变为结直肠癌转移，并对肿瘤细胞原代培养。入组10例患者随访3～20个月，2名患者消融灶周围复发、2名患者肝内远离消融灶复发，其余6例患者随访过程无复发。对2例病灶周围复发患者，我们完成了肝转移肿瘤细胞及射频后复发肿瘤细胞的原代培养，采用miRNA芯技术比较二者miRNA表达谱，筛选出miR-34a在复发肿瘤中变化最为明显，进一步用qRT-PCR方法检测两组细胞miR-34a表达情况，发现原瘤细胞中表达明显高于复发瘤细胞。之后又对复发前、后患者血浆标本进行了qRT-PCR进行了检测，发现复发后患者血浆miR-34a水平低于RHA术前，我们推测miR-34a有望成为早期诊断结直肠癌肝转移RFA后肿瘤残余及复发的标志物。.我们在体外实验研究了miR-34a对人结肠癌细胞株SW480增殖、侵袭和迁移能力的影响。通过miR-34a过表达的慢病毒转染SW480细胞，CCK8增殖实验证实过表达miR-34a可抑制SW480细胞增殖能力，划痕实验和Transwell小室实验证实过表达miR-34a可抑制SW480细胞的迁移和侵袭能力。Western blot实验证实miR-34a使E-cadherin蛋白表达增加、Vimentin蛋白表达降低，影响了肿瘤细胞上皮间质转化进程。通过皮下注射及脾脏注射法制作BALB/c-nu裸鼠皮下移植瘤及肝转移瘤模型，28天后处死裸鼠，过表达miR-34a组皮下移植瘤体积明显小于对照组、肝内转移瘤数目明显少于对照组，提示miR-34a可能作为一种“抑癌基因”影响肿瘤进展。.此外，我们还通过肝脏直接注射法制做了SD大鼠肝转移瘤模型，低能量消融模拟肿瘤残余，术后1周肿瘤体积逐渐减小、消融灶周围残余瘤区HIF-1α和Ki-67表达下降，术后2周肿瘤增长，体积与对照组无明显差异，残余瘤区HIF-1α和Ki-67表达恢复。此结果也进一步证实了不完全的消融术，可能刺激残余瘤细胞快速增长。