基因工程鲎素对副粘病毒与靶细胞膜融合的抑制机制

本研究在已获得规模化生产的高活性基因工程鲎素基础上，体外试验结果初步表明该鲎素对副粘病毒有高的抗病毒活性,其中鲎素可使新城疫病毒F48E9在体外对Vero细胞的蚀斑形成能力降低60%，对F48E9病毒的半数效应浓度(EC50)为8.2nM，间接免疫荧光法检测抑制病毒抗原表达的效率为50%。本研究拟使用NBD-C6-HPC荧光探针为指示，标记靶细胞膜脂质双层，通过激光扫描共聚焦显微镜检测细胞膜的流动性来确定鲎素对副粘病毒与靶细胞融合抑制作用的时段。通过膜表面等离子共振技术（Biacore 3000）确定鲎素与副粘病毒主要结构蛋白相互作用常数：RU值、结合常数、亲和力、结合时间、结合强度、解离时间等动力学常数，确定鲎素对副粘病毒的作用靶位。通过作用时段和靶位的确定，可望在抗菌肽的抗病毒作用机制分析方面积累一些经验，发现新的抗病毒靶位，为进一步明确和丰富抗菌肽抗病毒机制积累资料。

本项目以鲎素、副粘病毒与靶细胞之间相互作用关系为研究对象，证实了鲎素体外抗新城疫病毒作用效果，明确了鲎素抗新城疫病毒的作用时段和作用靶位，系统研究了鲎素对副粘病毒的抗病毒作用机制。鲎素体外抗病毒作用效果明显，10 µg/mL的鲎素对0.1MOI的新城疫病毒在Vero细胞培养体系中可减少65%的病毒蚀斑和57%的病毒载量。使用NBD-C6-HPC标记靶细胞，用激光共聚焦显微镜进行荧光淬灭实验证实，新城疫病毒吸附靶细胞后细胞膜的流动性会明显降低，而鲎素具有恢复细胞膜流动性的作用，阻止病毒囊膜与靶细胞膜的融合，在病毒穿入阶段阻断病毒对细胞的进一步侵染。使用DiBCA标记靶细胞，用流式细胞仪检测细胞膜电位，首次发现新城疫病毒F48E9株感染Vero细胞后可导致细胞处于超级化状态，鲎素可逆转受感染靶细胞的超极化状态来阻止病毒在靶细胞膜中的进一步穿入。使用Biacore-3000大分子相互作用仪检测鲎素与酵母表达的新城疫病毒表面结构蛋白HN和F蛋白相互作用，显示鲎素对HN和F蛋白均有较强的相互作用，且对F蛋白的作用强于HN蛋白，因此，鲎素可直接杀伤新城疫病毒、可干扰病毒与靶细胞受体吸附、可阻断病毒囊膜与靶细胞膜融合，新城疫病毒表面F蛋白是鲎素抗新城疫病毒的主要作用靶位。