甘油生物催化合成3-羟基丙酸的应用基础研究

The applied basic research on 3-hydroxypropionic acid production by dual-enzyme coupled reaction system from the renewable resources glycerol was carried out in this foundation project.In this catalysis process, glycerol was firstly catalyzed to 3-hydroxypropionaldehyde by glycerol dehydratase, and then to the product 3-hydroxypropionic acid by aldehyde dehydrogenase.The project had high research value because of the definit catalysis pathway and the simple method. The research was focus on the site directed modify and rational redesign on glycerol dehydratase and aldehyde dehydrogenase genes, and this could elucidate the relationship between catalytic activity and molecular structure of the two enzymes, gained the highly active enzymes. Another study point was the regulation and control of the dual-enzyme coupled reaction system, and a high-efficiency dual-enzyme coupled reaction system could be established by this research. This could reveal the law of the co-expression and balance experession of the two enzyme genes, and provide a theoretical guidance for the production of chemical product by dual-enzyme reaction system. This technology could not only reduce the producing cost of 3-hydroxypropionic acid and decrease the dependence on the petroleum resource, but also effectively use the glycerol and promote the development of the biomass energy industry.

本项目以可再生资源甘油为底物，构建一菌双酶催化体系，进行生物催化甘油合成重要的化工产品3-羟基丙酸的应用基础研究。该催化过程中甘油首先经甘油脱水酶的作用合成3-羟基丙醛，然后在醛脱氢酶的作用下合成产物3-羟基丙酸，路径明确，方法简单，具有较高的研究价值。通过对两个酶的分子改造及其酶分子的理性设计，阐明甘油脱水酶和醛脱氢酶的催化活性与酶分子结构之间的关系，获得高活性的甘油脱水酶和醛脱氢酶；对一菌双酶偶联反应的调节与控制及反应机制的有关科学问题进行深入的应用基础研究，建立高效的一菌双酶反应及控制系统，揭示甘油脱水酶和醛脱氢酶基因串联表达调控及耦合过程中平衡表达的规律，为一菌双酶偶联生物催化生产大宗化工产品提供基础理论指导。这一技术的深入研究既能降低3-HP的生产成本，减少大宗化学品的合成对石油资源的依赖，又能有效利用甘油，促进生物质能源产业的顺利发展，具有重大的经济和社会价值。

本项目以可再生资源甘油为底物，构建基因工程菌株，通过发酵合成3-羟基丙酸（3-HP）。该项目的深入研究既能降低3-HP的生产成本，减少大宗化学品的合成对石油资源的依赖，又能有效利用甘油，促进生物质能源产业的顺利发展，具有重大的经济和社会价值。项目通过代谢途径中关键酶的分子改造及载体重建，副产物代谢途径的敲除等方法构建了可以利用甘油合成3-羟基丙酸的重组菌株，后续利用该菌株考察了该菌株的催化特性，并优化了甘油发酵合成3-羟基丙酸的过程。对醛脱氢酶KGSADH的氨基酸位点120E、163K、177K、219P、225K、252E、278K 进行点突变。发现在以乙醛为底物时，带突变点E120D、K177R、P219A的酶比活力分别得到较大提高，比酶活分别是原始酶的1.84、1.61和1.54倍。当采用两点组合突变KGSADH时，E120D/P219A突变酶的比活力最大可以提高4.22倍。克隆来源于K. pneumoniae DSM 2026甘油脱水酶基因dhaB及甘油激活因子基因gdrA，得到重组质粒pACYCDuet-tac-dhaB1-4质粒和pTrc99a-dhaB1-4质粒；测得其甘油脱水酶比活力分别为9.59U/mg和8.94U/mg。分别敲除形成副产物1,3-PDO的主要酶基因——乙醛脱氢酶基因yqhD和甘油代谢途径中的抑制因子glpR基因，其工程菌3-HP产量分别提高了10.42倍和9.40倍。后续研究了3-羟基丙分批发酵工程的补料工艺，考察了甘油添加和葡萄糖添加对发酵过程的影响。发现甘油和葡萄糖分批补加的最佳时机分别为选择甘油浓度下降至15 g/L开始补料；选择葡萄糖浓度下降至3 g/L开始补料。当采用甘油恒速补料流加时，细胞干重最大达到11.84 g/L，产物3-羟基丙酸产量达到16.45 g/L；葡萄糖恒速补料流加时，细胞干重最大值达13.27 g/L，产物3-羟基丙酸为15.02 g/L；当葡萄糖和甘油混合补料时，最佳工艺为在8 h开始恒速流加葡萄糖，14 h开始恒速流加甘油，最后菌体干重最大达13.80 g/L，产物3-羟基丙酸最大产量达17.20g/L。该课题为重组大肠杆菌以甘油为底物合成3-羟基丙酸的研究奠定一定的理论基础，有助于加快3-羟基丙酸的产业化步伐。