紧密连接蛋白Claudin-1在蛋白尿肾病中的作用机制研究

In renal glomerulus, the podocyte forms a specialized cell-cell junction known as the slit diaphragm (SD) that is one of the major impediments to protein permeation across the glomerular filtration barrier. Under nephrotic conditions, the membrane of foot processes comes into close apposition and forms tight junction (TJ) like structures between the neighboring processes with increased expression of the TJ proteins, especially the Claudins (CLDN). We have recently demonstrated that podocyte specific overexpression of CLDN1 gene caused the development of progressive proteinuria and the striking anatomic change of SD to TJ transition in podocyte cell junction on the ultrastructural level. These changes prompt us to address the central hypothesis that Claudin triggered SD to TJ transition may represent a common mechanism underlying malformation of the glomerular filtration barrier. This grant aims to comprehensively analyze the biochemical composition and the biophysical permeability of the SD transformed TJ both in vitro and in vivo. Since diabetic nephropathy (DN) is the most common cause of nephrotic syndrome, we plan to measure Claudin-1 expression and TJ formation to determine its value as a marker for the early diagnosis of DN，followed by addressing how to correct the SD to TJ transition in vivo as potential therapy for DN using transgenic mouse tools acting upon CLDN1.

肾小球足细胞足突间裂孔膜 (SD)作为一类特殊的细胞间连接体形成了肾小球滤过的最后屏障。蛋白尿肾病时相邻足突细胞膜相互靠近形成类似紧密连接（TJ）的结构，同时伴有Claudin（CLDN）等TJ相关蛋白分子表达的增加。我们近期研究证实，足细胞特异性过表达CLDN1的转基因小鼠出现蛋白尿，超微结构水平可见足突间SD到TJ的转变，这一现象提示由Claudin分子触发的SD到TJ的转变可能代表了蛋白尿肾病状态下肾小球滤过屏障功能异常的一个普遍机制。本项目计划解析由SD转变的TJ的蛋白组成、功能及结构，提出蛋白尿发生机制的新观点；并以糖尿病肾病为研究对象，确定CLDN1分子的表达及SD到TJ的转变是否与足细胞损伤病理过程有关，以探索其作为疾病早期诊断标志物的价值；通过足细胞特异性基因敲除小鼠模型，研究CLDN1分子缺失能否改善糖尿病肾病的蛋白尿水平及足细胞损伤，以探索新型足细胞损伤干预靶点。

足细胞损伤是肾小球疾病的中心环节，明确足细胞损伤分子机制对寻找新型肾小球损伤诊断标志物和治疗靶点具有重要意义。在胚胎发育过程中肾小球发生的早期阶段，未成熟足细胞之间存在紧密连接结构，随着足细胞的发育成熟及初级次级突起的伸出，顶端的紧密连接逐渐向底部迁移并消失，最终转变为裂隙膜来连接相邻足细胞之间伸出的足突结构。尽管成熟足细胞相邻足突间正常情况下没有紧密连接结构，但紧密连接跨膜蛋白claudins（CLDNs）分子在足细胞生理或病理情况下表达。本项目着重研究了CLDN与足细胞损伤的关系，进一步通过构建足细胞特异性CLDN基因敲除和转基因小鼠模型研究其在糖尿病肾病足细胞损伤中的作用及其机制。本项目研究结果显示糖尿病肾病小鼠肾小球足细胞CLDN1表达增加，导致相邻足突间裂隙膜转换为紧密连接结构，进而加重蛋白尿。但与我们预期结果不同，足细胞特异性敲除CLDN1并未改善糖尿病肾病小鼠蛋白尿，并且电镜下仍可见融合的足突间紧密连接结构的形成，提示其他紧密连接蛋白分子的存在。磁珠灌流法分离肾小球后实时荧光定量PCR测定紧密连接结构和功能成分CLDN1至CLDN24基因表达情况，结果显示，与其他CLDN分子在肾小球表达量极低相比，CLDN5在正常对照组及糖尿病肾病组的肾小球组织均有明显表达，故后续进行了CLDN5与糖尿病肾病关系的研究。糖尿病肾病小鼠模型足细胞CLDN5表达显著低于对照组，足细胞CLDN5缺失加重糖尿病肾病肾脏损伤，机制方面，足细胞CLDN5缺失可在转录水平调控基因表达进而激活信号通路，导致足细胞损伤。我们的上述研究提出了关于CLDN和紧密连接在生理和病理条件下在肾脏作用的新观点，对于更深入理解上皮细胞生物学具有重要意义，同时也对探索蛋白尿相关性肾病的发病机制、筛选发现治疗蛋白尿的有效药物或工具药具有非常重要的理论意义和实际应用价值。