microRNA信号通路抑制抗癫痫基因PRG-1表达的机制研究及其在小鼠癫痫治疗中的应用研究

The anti-epileptogenic protein PRG-1 can reduce the levels of synaptic lysophosphatidic acid (LPA) and glutamate neurotransmitter and thus suppress the recurrence of epilepsy. The level of PRG-1 protein in hippocampus induced by initial epilepsy was significantly decreased but its mRNA expression was unchanged, however, the molecular mechanism of PRG-1 protein decrease is completely unclear. We found that levels of four miRNAs (mir-221, -301b, -30a, -29c) capable of binding PRG-1 3'UTR were significantly increased in the hippocampus of epileptic animals, suggesting that they may suppress the translation of PRG-1 mRNA, eventually leading to the recurrence of epilepsy. We plan to: 1) test whether these miRNAs inhibit PRG-1 mRNA translation at the cellular level; 2) silence these miRNAs or apply the LPA receptor LPA2 antagonist H2L5186303 in epileptic animals, and measure whether this will affect: the symptoms of animal epilepsy, the level of PRG-1 mRNA and protein in hippocampus, levels of synaptic LPA and glutamate, and excitability of hippocampal neurons, the degree of neuronal apoptosis, and degree of oxidative stress and brain injury. This project theoretically attempts to elucidate a new miRNA signaling pathway that leads to the recurrence of epilepsy and to provide a new clinical direction for the treatment of epilepsy.

抗癫痫蛋白PRG-1能降低突触间的溶血磷脂酸（LPA）和谷氨酸神经递质水平而抑制癫痫复发。初始癫痫导致的海马区PRG-1 蛋白水平显著下降但mRNA表达不变，但是其机制完全不清楚。我们发现四种能结合PRG-1 3’UTR的miRNA (mir-221, -301b, -30a，-29c)表达量在癫痫动物海马区显著提高，因此推测它们可能抑制PRG-1 mRNA翻译而导致癫痫复发。我们计划：1）在细胞水平上检测这些miRNA能否抑制PRG-1 mRNA翻译；2）在癫痫小鼠中沉默这些miRNA或应用特异的LPA受体LPA2拮抗剂H2L5186303，然后检测是否影响：癫痫症状、海马区PRG-1 mRNA和蛋白水平、突触间LPA和谷氨酸水平、神经元的兴奋性、海马神经元损伤及癫痫复发频率及程度。本项目在理论上试图阐明一个新的导致癫痫复发的miRNA信号通路，并且在临床上提供一个新的治疗癫痫的方向。

癫痫是常见的慢性神经系统疾病之一，除会引起患者海马神经元损伤和死亡外，还可导致严重的脑损伤和继发性认知功能障碍。目前，癫痫的治疗主要依靠药物，其中约30％的癫痫为药物难治性癫痫，一线的抗癫痫药物仅仅是控制癫痫发作，而不能有效的改善癫痫患者的认知功能障碍。所以，寻找新的药物治疗靶点，开发新的癫痫治疗药物，就变得迫不及待。本研究发现circHivep2和NCBP1是与癫痫发病相关的新的关键分子，同时，脂肪源性干细胞（ADSCs）源性circHivep2过表达外泌体还能顺利通过血-脑屏障发挥其抑制癫痫发作的作用，这些发现为癫痫的治疗提供了新的思路和药物靶点。实验建立小鼠SE损伤模型，鉴定SE小鼠海马组织的circRNAs表达谱，对表达差异明显的circRNAs进行分析，发现 circHivep2在SE小鼠海马中表达下调，进而阐明circHivep2通过调控miRNA-181a-5p/SOCS2通路抑制小胶质细胞的激活，同时我们构建了ADSCs源性 circHivep2过表达外泌体，成功解决了circRNAs不易穿过血-脑屏障的关键难题，并证实circHivep2过表达外泌体可以抑制SE小鼠的癫痫发作。我们还分析了SE小鼠海马组织的蛋白质组学，对差异表达蛋白进行分析后发现NCBP1在SE小鼠海马中表达水平下调，在Neuro2a细胞中敲低NCBP1可导致细胞活力下降，凋亡增加，表明NCBP1在SE发病中起到了关键的作用。随后，我们在SE小鼠海马中过表达NCBP1，并阐明了NCBP1可以通过减少SE后海马组织中的氧化应激、神经元缺失和神经胶质细胞激活来改善小鼠的认知功能，最后通过CO-IP实验验证了ELAVL4是NCBP1的潜在作用靶点。这些研究为临床中癫痫的治疗提供了新的药物作用靶点，不仅具有十分重大的临床转化价值，同时也为脑科学研究提供了重要的理论依据。