中药中CRF受体结合成份的分离及其影响糖尿病肾病进程的研究

我们以前的研究表明，促肾上腺皮质激素释放激素受体（CRF-R）激动剂urocortin可明显改善糖尿病肾病(DN)模型的肾脏功能，而CRF-R受体拮抗剂astressin能够拮抗urocortin的这一效应，这提示CRF-R激动剂有可能成为防治DN的一类新药物。本课题拟以内皮细胞/肾小球系膜细胞为对象，建立CRF-R特异性细胞膜固相色谱法：采用实验手段（使用拮抗剂、抗体、siRNA）使细胞表面的CRF-R失去功能或不表达，以此种细胞和正常细胞分别固相化同一中药的成分，比较得到的色谱特征图谱，缺少的峰即为与CRF-R特异结合的成分，以此法分离防治DN常用经典古方和经验方中能与CRF-R结合的成分，并对这些成分的内在活性进行评价，以期得到中药中通过作用于CRF-R而改善DN的成分，为DN的治疗提供新思路，也为将经典的细胞膜固相色谱法发展成为分离作用于特异受体成分的分离方法进行有益

金匮肾气丸和六味地黄丸是防治糖尿病(DM)及其并发症的经典方剂。本研究使用人体脐静脉内皮细胞（HUVEC）和肾小球系膜细胞（MC），采用细胞膜亲和色谱法，对金匮肾气丸和六味地黄丸的成分进行分析，寻找其中可能影响DN进程的成分；经过质谱分析和高效液相分析后确认为丹皮酚。同时，本研究还对古方血府逐瘀汤和玉液汤，经验方如复肾汤、尿毒清，单味药如知母、地骨皮、玄参等进行了同步研究。结果表明，玄参水提液中哈巴俄苷可可与HUVEC细胞膜相结合，其他单味药或复方中未检测到与细胞膜结合的成分。使用CRF受体拮抗剂后，丹皮酚仍然可以和细胞膜结合，出现这种结果的原因可能有：化合物不与CRF受体结合或拮抗剂不能完全占据所有受体。所以，研究者考虑采用转染的方法过度表达目标蛋白来寻找特异性结合的化合物应该更为合理和具有更高的可操作性。由于研究经费和研究期限的限制，本研究仅对丹皮酚的药理学效应进行了评价。离体实验部分我们采用MTT法观察不同浓度的丹皮酚对高糖诱导MC的增殖的影响。整体动物模型评价部分研究了丹皮酚对链脲佐菌素诱导的DN（I型）模型和db/db鼠DN（II型）模型病变进程的影响。1. 雄性Wistar大鼠采用链佐星和弗氏完全佐剂制作DM动物模型。DM大鼠分为DN组和丹皮酚组。DN组灌胃给予3%羧甲基纤维素钠溶液，丹皮酚组灌胃给予不同剂量的丹皮酚（11、33 mg/kg）混悬液，连续13周。测定血清超氧化物歧化酶（SOD）活力、丙二醛（MDA）、尿素氮（BUN）、肌酐（Crea）、总胆固醇（Chol）、甘油三酯（TG）。普通石蜡切片、HE和PAS染色及免疫组织化学法观察肾脏病理变化。结果表明，DN动物出现明显肾脏病变，肾小球基质聚积，纤连蛋白（FN）和血管内皮细胞生长因子（VEGF）表达显著增；丹皮酚明显减轻DN大鼠肾脏病变，提高SOD活性，降低MDA、BUN、Cr、Chol和TG含量；同时，肾小球VEGF表达降低。2. 雄性db/db鼠按血糖分为模型、丹皮酚不同剂量组（13、39mg/kg），对照组选用野生型C57小鼠。对照组灌胃给予3%羧甲基纤维素钠溶液，丹皮酚组灌胃给予不同浓度丹皮酚混悬液，13周以后采集血清及肾组织，测定血清中Chol、Crea、BUN、SOD、MDA等生化指标；肾组织行普通石蜡切HE&PAS染色，免疫组织化学法检测肾组织VEGF、FN的表达。结果表明，丹皮酚