羟甲基化胞嘧啶参与从头甲基化/去甲基化

本实验室前期曾经利用p16、POPDC3和Bikunin等基因的表达和甲基化状态均不同的人MGC803和AGS细胞构建了一融合细胞模型，结果表明在融合细胞中，p16、POPDC3以及Bikunin等基因CpG岛除了部分维持了原母细胞的甲基化状态和非甲基化状态外，在一些亚克隆中存在明显的甲基化变异现象。据此，我们提出一个基因的甲基化状态不是静态不变的，而是由甲基化/去甲基化平衡的状态来决定的，而羟甲基化胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）有可能作为胞嘧啶和甲基化胞嘧啶的一个中间产物，在甲基化动态过程中扮演重要角色。在本项目中，我们采用羟甲基化DNA免疫沉淀法（hMeDIP）技术，的确发现上述融合细胞的p16启动子区域能被5hmC特异抗体富集。同时开展 tet1催化形成5hmC的可能机制，对发掘深层次的DNA甲基化/去甲基化形成机制进行探索。

众所周知，p16基因甲基化与癌变密切相关，而其发生过程并不是一蹴而就，其发生必然是一个逐步积累的动态变化过程。但是迄今为止这方面尚无研究。此工作首先建立融合细胞模型，针对p16基因，在两个母细胞中存在甲基化状态差异基因，结合母细胞SNP多态，判定在融合细胞系发生动态甲基化/去甲基化过程的研究；p16基因在MGC803细胞中非甲基化而在AGS细胞中甲基化。其融合细胞表现为，CpG岛除了仍然维持了原母细胞的甲基化特征外，还呈现不同程度的半甲基化状态，在融合细胞发生重编程过程中甲基化的动态变化来阐明发生从头甲基化和去甲基化现象。此现象在天然细胞系HCT116中亦存在。并用染色体免疫共沉淀检测其组蛋白甲基化状态。P16 表达用免疫组化和RT-PCR证实。融合细胞在细胞传代至60代，仍能保持上述特征。而在这动态变化的27%等位基因中可观察到羟甲基化参与，但原母细胞的甲基化状态不受影响。即使单克隆化后仍保留此特征。此现象在p16半甲基化的 HCT116细胞系中重现。进一步研究了P16羟甲基化形成的机制。通过对P16转录起始位点上下游片段正反义链的甲基化和羟甲基化状态分析，发现P16的羟甲基化在正反义链存在不对称分布，且在第一外显子区和启动子区的羟甲基化状态不同。第一外显子区反义链存在甲基化而正义链无甲基化，而在启动子区，则是第一外显子区反义链无甲基化而正义链存在甲基化，由此初步推断P16羟甲基化形成可能与基因的复制过程有关。