SDF-1双重“趋化”调控视网膜神经节祖细胞归巢及其轴突再生研究

视神经损伤后视网膜神经节细胞（RGC）死亡、轴突崩解是视觉受损、失明的病理基础。较干细胞及成熟细胞而言，视网膜神经节祖细胞（RGPC）具有独特的优越性，可更有效再生RGC，但其归巢率低、轴突生长受抑制。基质细胞衍生因子-1(SDF-1)是一种关键的趋化因子，可与其受体CXCR4耦合促进细胞迁移及归巢。在前期分离RGPC，发现其再生轴突并表达CXCR4受体的基础上，我们提出SDF-1通过与CXCR4结合，发挥"双重趋化"作用的假说：既介导RGPC整体迁移-归巢，又作用于再生抑制的节点Rho/Rock通路，促进RGPC "局部迁移"-轴突生长。我们拟先体外观察SDF-1对RGPC迁移及轴突再生影响，然后建立视神经损伤模型，评价SDF-1在移植RGPC归巢及轴突再生中的作用及机制。本研究期望在前期工作的基础上，利用RGPC的修复和调控为有效防治视神经损伤提供新的思路。

损伤后视网膜神经节细胞（RGCs）死亡构成了不可逆视觉受损的病理生理基础。本研究取孕14天的Long-evans大鼠胚胎视网膜组织，培养获得视网膜干细胞,鉴定其表达Nestin 及CHX-10，并以BDNF及DAPT诱导细胞分化，并经Math5、RPF-1、brn-3b等视网膜神经节前体细胞的特征性鉴定物鉴定，可定向诱导分化为Thy1.1阳性的RGCs，并具有了RGCs的某些电生理特性，提示上述细胞为视网膜干细胞向成熟RGCs分化过程中的“中间”细胞群，即视网膜神经节祖细胞（RGPC）。基质细胞衍生因子-1（SDF-1）属于CXC 族趋化因子成员，在视网膜中有表达。CXCR4是SDF-1主要的耦合受体，表达于RGPC细胞中，SDF-1可与细胞表面CXCR4 结合，活化CXCR4 受体耦联的G蛋白，激活局部黏附蛋白，从而介导细胞迁移。将RGPC悬液接种于transwell小室中，结果发现SDF-1能够趋化更多RGPC向着SDF-1 高浓度区域迁移，使定向分化的视网膜神经节祖细胞的数量增加；同时SDF-1在培养4d，6d后使轴突长度明显增加（P<0.05），且促轴突生长作用随浓度梯度而增加。. 建立在体Long-evans大鼠视神经不全损伤模型，观察损伤后视网膜SDF-1表达变化：损伤后3天出现增强，2周增强达到高峰，4周出现下降。将DiI标记的RGPC细胞经巩膜外路法移植入视神经不全损伤Long-evans大鼠的视网膜下腔，检测移植细胞存活、迁徙、分化，以及宿主视功能改善情况。结果发现，移植细胞在大鼠视网膜内可以存活至120d，并有向视网膜内层迁徙的趋势；初期移植细胞存活数量较多，主要分布在视网膜外核层，后期移植细胞存活数量减少，较多分布在视网膜神经节细胞层。RGPC联合SDF-1移植，有利于移植细胞在损伤大鼠视网膜内存活，并具有向定向分化的能力。应用视网膜电图（ERG）检测RCS大鼠视功能改善情况，Rod-ERG b波及Max-ERGb波振幅及潜时进行统计比较发现，RGPC移植在术后1月及2月时可改善大鼠视功能。. 本研究结论：利用BDNF及DAPT诱导视网膜干细胞分化RGPC细胞，SDF-1可诱导RGPC的迁移，并促其轴突的生长。RGPC联合SDF-1移植，移植后细胞在RCS大鼠视网膜内具有定向分化的能力，并显著改善损伤后大鼠后视功能。