直接捕捉活体细胞中蛋白质去修饰酶的新方法及作用机制研究

Post-translational modifications (PTMs) modulate diverse cellular functions，PTM signaling networks are dynamic and interconnect cellular responses. Given the importance of PTMs in regulating biological processes and the critical need to understand cellular signaling pathways, it is important to developing methods to allow efficient and comprehensive identification of proteins or enzymes that interact with PTMs. This project will focus on developing novel unnatural amino acids (UAAs) that mimic protein specific residue modification. We propose to develop a general method that would exploit genetically encoded electrophilic UAA capable of reacting with nucleophilic residues at functional sites in enzymes, thus direct identification of the functional site of protein-enzyme interactions. On the basis of success of the covalent capturing of the interacting enzymes involved in PTM process, thus, the irreversibility and stability of the covalent crosslinking allows for directly analysis of protein-enzyme interactions and identification of the specific site of the original protein modifications with mass spectrometry. This new, straightforward protocol for rapid capturing of the enzymes involved in dynamic PTMs and functional site analysis has great usefulness in protein-protein interactions and mass spectrometry-based proteomics, thus, may lead to further discovery of the specific roles and functional significance of PTMs in cells with the potential to reveal novel signaling pathways. In addition, this strategy can be generally expanded to study other protein activities encompassed by diverse protein classes in cellular functions and diseases.

蛋白质翻译后修饰(PTMs)的动态平衡影响和决定着蛋白质的功能和细胞的命运，发现并鉴定修饰调控的蛋白质-酶相互作用，有助于发现修饰酶和去修饰酶在目标蛋白质作用网络中的调控机制和信号通路中的关键作用。本项目主要开展在目标蛋白质中定点引入模拟蛋白质特定位点修饰的非天然氨基酸，构建活体细胞内特定的修饰模型；通过非天然氨基酸与去修饰酶中天然氨基酸的亲核性侧链共价交联，能够成功捕捉和发现活体细胞中蛋白质去修饰酶并鉴定其作用位点。本项目的顺利实施，能够发现重大疾病相关的蛋白质新的去修饰酶，有助于揭示去修饰酶在蛋白质作用网络中的调控机制和新功能。该技术成功应用，在一定程度上突破当前鉴定翻译后修饰调控的蛋白质-酶相互作用的技术瓶颈，为蛋白质相互作用研究和蛋白质组学研究提供有效的方法和技术手段；有助于挖掘PTMs在蛋白质调控网络中的作用机制，发现在重大疾病中蛋白质的新功能，揭示其在信号转导途径中的关键作用。

细胞中蛋白质修饰酶和去修饰酶调节无数翻译后修饰底物的动力学行为，蛋白质翻译后修饰异常广泛参与各种复杂疾病的发生发展。因此，精确表征酶与底物的关联性对于细胞功能和表型的分子基础至关重要。本项目主要围绕细胞中蛋白质翻译后修饰和去修饰酶的相互作用、蛋白质底物与修饰酶的捕捉开展研究。. 本项目第一部分，基于基因密码子扩展技术, 在目标蛋白在中定点引入非天然氨基酸, 为底物与去修饰酶的研究提供有效的化学生物学工具。研究发现在全长的目标蛋白质中定点引入苯甲酰修饰赖氨酸与去修饰酶的相互作用，与传统合成修饰的肽段与去修饰酶之间，具有不同的动力学行为。进一步研究发现该技术可以用于哺乳细胞中的修饰底物与去修饰酶之间的相互作用研究。更为重要的是，该技术为研究在病理条件下，蛋白质修饰与去修饰酶领域的研究提供了有效的化学生物学工具。. 另一方面，基于基因密码子扩展技术，在完成去修饰酶的研究外，还开展了底物与修饰酶之间相互作用的研究。我们开发了一种在活体细胞中直接捕捉底物与修饰酶的新技术，该技术为准确、全面阐明酰基化修饰酶的直接底物和修饰位点提供了新方法。研究发现底物的新功能并提示多个酰基化修饰酶参与代谢、翻译过程中调控、细菌耐药性等多个的生物学过程。此外，基于这些研究和对非天然氨基酸光化学反应的深入认识，我们开发一种新的多功能光点击化学反应PANAC Photoclick，该方法可用于体外及活细胞中蛋白质的修饰研究，有望为化学生物学领域提供新的强有力工具，并获得广泛的应用。. 综上，本项已发表SCI论文4篇分别为 Chem. 2019, 5, 2955；Nat. Commun., 2020, 11, 5472; ACS Chemical Biology, 2021, 16, 2560; RSC Advances, 2021, 11, 2235。开发相关的新技术已申请中国发明专利2项，培养博士生1名、硕士生3名。通过该项研究，这些开发的新技术有望在蛋白质相互作用、蛋白质组学等领域获得广泛的应用，为发现活体细胞中新的蛋白质相互作用、底物与修饰酶、蛋白质功能与疾病的关联性的研究提供强有力的工具；为发展具有自主知识产权的相关技术提供支撑。