基于AMPK/SREBP-1c信号通路研究古方黄芪散有效部位群改善肝脏胰岛素抵抗的调控机制

Lipotoxicity is one of important reasons leading to hepatic insulin resistance. “The guard of lipotoxicity”—sterol regulatory element binding protein 1c (SREBP-1c) is the transcription factor regulation of fatty acid and triglyceride synthesis, and affect the hepatic insulin signal transduction. Recent studies have shown that AMPK- modulated SREBP-1c Ser372 phosphorylation，supresses SREBP-1c cleavage and nuclear translocation,leading to reduced lipogenesis and lipid accumulation. Preliminary studies showed that a ancient prescription for “XiaoKe”, HuangQiSan (HQS) effective fractions improved insulin resistance, reduced hepatic steatosis in mice, which mechanism may be related to promote AMPK phosphorylation, and inhibit hepatic SREBP-1c gene expression. So we hypothesis that the key point of improving hepatic insulin resistance is through AMPK-modulated SREBP-1c phosphorylation to affect excessive lipid synthesis and hepatic insulin signal transduction. We plan to use two kinds of transgenic animal model of insulin resistance，and insulin resistance cell model，combined the techniques of siRNA and mutation plasmid. Arrounding hepatic lipid syntesis relevant mechanism and IRS-2/PI3K signaling pathways，we will reveal and verify regulatory mechanism of HQS improving hepatic insulin resistance.

脂毒性是导致肝脏胰岛素抵抗的重要原因。“脂毒性的门卫”——固醇调控元件结合蛋白-1c (SREBP-1c)是调控脂肪酸和甘油三酯合成的转录因子，并影响肝脏胰岛素信号传导。近期研究表明，肝脏单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)可直接介导SREBP-1c Ser372磷酸化，抑制后者的剪切和入核，从而减少脂质生成和聚集。前期研究显示，治疗消渴的古方黄芪散有效部位群（黄芪散）能改善2型糖尿病小鼠胰岛素抵抗、减轻肝脏脂肪变性，其机制与促进AMPK磷酸化、抑制肝脏SREBP-1c基因表达有关。故设想：黄芪散改善肝脏胰岛素抵抗的关键是通过AMPK介导的SREBP-1c磷酸化影响脂质过多合成和胰岛素信号传导。拟采用两种转基因型胰岛素抵抗动物模型和胰岛素抵抗细胞模型，结合siRNA和磷酸化位点突变质粒技术，围绕肝脏脂质合成相关环节和IRS-2/PI3K信号通路，揭示和验证黄芪散改善肝脏胰岛素抵抗的分子机制。

依据项目的科学假说，完成以下研究工作。①分别采用两种胰岛素抵抗动物模型——高脂纯化饲料诱导的肥胖大鼠和高脂纯化饲料联合STZ诱导的Ⅱ型糖尿病胰岛素抵抗大鼠，从整体动物水平证实黄芪散有效部位群（HQS）通过调控AMPK/SREBP-1c信号通路抑制脂质合成并影响胰岛素信号传导而改善肝脏胰岛素抵抗。②利用HepG2细胞胰岛素抵抗模型，从体外细胞水平证实HQS对胰岛素抵抗具有改善作用，同时初步阐明SREBP-1c在HQS调控TG沉积过程中具有重要作用。③运用胰岛素抵抗HepG2 细胞模型并结合AMPK 激动剂和抑制剂，证实HQS主要活性成分黄芪甲苷（AST）通过AMPK 介导的 SREBP-1c Ser372 磷酸化调控了肝脏以TG为主的脂质合成及IRS-2/PI3K 信号通路。④采用SREBP-1c S372A突变质粒转染HepG2细胞模型，反证SREBP-1c Ser372位点是AST调控AMPK/SREBP-1c信号通路的关键靶点。同时，结合双荧光素酶报告基因技术证实AMPK介导的SREBP-1c Ser372磷酸化可直接调控下游IRS-2基因的转录进而影响胰岛素信号传导。上述研究阐明了AMPK介导的SREBP-1c磷酸化信号通路是HQS改善肝脏胰岛素抵抗的重要机制和靶点，为古方黄芪散的开发和应用提供新的理论基础。