雷氏大疣蛛毒素RNTX-A28抑制电压门控质子通道的分子机制研究

Despite a vital role of voltage-gated hydrogen channels (HV1) in the innate immunology, sperm maturation, as well as in the proliferation and invasion of cancer cells, its pharmacology is largely unexplored due to the scarcity of modifiers. Up to date, only Zn2+ and guanidine derivatives were reported to be effective HV1 blockers. Our previous study aimed to identify HV1 blockers from peptide toxins. About 600 RP-HPLC fractions from several venoms were screened and RNTX-A28 from the venom of spider Macrothele raveni was confirmed to be an antagonist of HV1 with high affinity (IC50 ≈ 1 µM) and specificity. To our knowledge, this is the first report of a peptide toxin acting on HV1. The structure and the interaction mode of RNTX-A28 acting on HV1 were completely different from those of Zn2+ and guanidine derivatives, which indicates the binding site of RNTX-A28 in HV1 is novel. In-depth study aims to uncover the mechanism by which RNTX-A28 interacts with HV1 by patch-clamp, 2D-1HNMR and mutation analysis. Meanwhile, the effect of RNTX-A28 on the proliferation and invasion of MDA-MB231 cells by inhibiting its endogenous proton currents will be explored. In summary, our study provided a useful probe for exploring the structure, function and the pharmacology of HV1. In addition, RNTX-A28 would be a potential drug lead for the development of drugs targeting HV1.

电压门控质子通道在先天免疫、精子成熟及癌细胞增殖侵袭等过程中具有重要作用，是一个潜在的药物靶点。由于至今仅有Zn2+和胍基衍生物两类抑制剂，限制了该通道的药理学研究进展。为了鉴定质子通道抑制剂，对本室储存的多肽毒素库进行了大规模筛选，获得了首个高活性和高专一性的多肽抑制剂RNTX-A28。相比于上述两类抑制剂，该多肽有完全不同的分子结构和作用模式，是一个新型的质子通道抑制剂。本项目以阐明专一性质子通道抑制剂RNTX-A28的作用机制为目标，利用膜片钳、2D-1HNMR、基因突变等技术解析该多肽抑制质子通道的作用模式、相互作用的结构基础，并初步探讨它对乳腺癌细胞增殖及侵袭能力的影响。通过对该多肽作用机制的深入解析，将为质子通道结构与功能、药理学等研究提供一个重要分子工具及潜在的药物先导分子；同时，还将发现质子通道上一个新的药物结合位点，扩展和深化抑制剂与质子通道相互作用的理解。

电压门控质子通道Hv1在免疫细胞呼吸爆发、不孕症、关节炎、脑缺血以及癌症等生理病理过程中具有重要作用。Hv1通道调制剂可作为研究其结构与功能关系的分子探针，同时基于Hv1通道调制剂开发药物用于疾病治疗也极富应用前景。通过对多种有毒动物毒液的HPLC分离组分进行大规模筛选，我们发现东亚钳蝎毒液中的抗癌活性肽AGAP是一个新的Hv1通道调制剂。在+30 mV的去极化电压下，AGAP抑制Hv1通道电流的半数有效浓度为2.5 ± 0.4 µM。同时，1 µM AGAP可明显抑制电压门控钠通道NaV1.3-1.5和NaV1.7的快失活。通过将AGAP蛋白序列中的第38位色氨酸残基突变成苯丙氨酸，我们成功去除了其钠通道活性但不损害其Hv1通道抑制活性，获得了一个选择性被优化的Hv1通道抑制剂-AGAP/W38F。电生理实验表明AGAP/W38F是一个Hv1通道门控调制剂，显著减缓通道的激活但加快其去激活过程，我们推断AGAP/W38F将通道的S4电压敏感元件稳定在去激活构象。与经典的Hv1通道抑制剂Zn2+类似，AGAP/W38F可结合处于关闭和激活状态的Hv1通道，但AGAP/W38F抑制Hv1通道电流的pH依赖性较Zn2+更弱。点突变实验表明Hv1通道上的H140、H193和E196是结合AGAP/W38F的关键氨基酸残基。有趣的是，H140和H193也是Zn2+的结合位点。突变Hv1通道上参与结合Zn2+的另外两个关键氨基酸残基，E119和D123,以及通道上参与结合hanatoxin的D185,都不改变AGAP/W38F与通道的亲和力。因此AGAP/W38F在Hv1通道上的结合口袋与Zn2+部分重叠但与hanatoxin不同。AGAP/W38F是如何将Hv1通道的S4稳定在去激活构象抑制通道电流的呢？已有研究表明突变Hv1通道内部静电互作网络中的E153残基显著减弱通道与Zn2+的亲和力，结合分子动力学模拟表明Zn2+结合至通道外部通过增强通道内部的E153-R208盐桥互作将S4稳定在去激活构象。通过类似手段我们也证实了AGAP/W38F通过该机制发挥作用。综上，本研究表明占据Hv1通道上的Zn2+结合口袋必定会导致通道电流的抑制，因而该位点是一个设计Hv1通道调制剂的热点。同时，AGAP/W38F是一个研究Hv1通道的优秀分子探针和靶向Hv1通道开发药物的先导分子。