蛋白质在离子交换界面上吸附行为的原位检测与调控

Ion exchange chromatography is widely used in the separation，purification and refinement of biological macromolecules. The protein adsorption behavior on the surface of ion exchange chromatography media has been a hot topic at home and abroad. To reseach the adsorption behavior can study adsorption -desorption proess of ion chromatographic medium on the molecular levels, contribute to a better understanding of the reaction mechanism of ion exchange chromatography and help to prepare the new type of ion exchange chromatography media. This project will use lysozyme, bovine serum albumin and immunoglobulin as model proteins to research the adsorption behavior on the surface of DEAE anion exchange chromatography medium and explore methods to maintain the spatial structure with high biological activity. This project uses the LB films (Langmuir-Blogett Film) technology to establish a DEAE agarose film. Then studies adsorbed protein binding sites by LC-MS and protease cut and protein adsorption space structure by quartz crystal microbalance and atomic force microscopy to in situ detect the protein adsorption behavior on the interface of ion exchange chromatography. All these can serve as guide studies of ion exchange chromatography purification process.

离子交换层析是一种广泛应用于生物大分子的分离、纯化和精制的高效分离方法。蛋白质在离子交换层析介质表面的吸附行为是国内外的研究热点。研究蛋白质在层析介质上的吸附行为，能从分子水平上研究吸附-解吸过程，有助于深入了解离子交换层析的反应机理，从而制备高效新型的离子交换层析介质。本项目用溶菌酶、牛血清白蛋白、免疫球蛋白三种球蛋白作为模型蛋白，研究模型蛋白在DEAE阴离子交换层析介质表面的吸附行为，同时探索形成有利于保持其生物活性的空间结构的调控方法。本项目利用LB膜（Langmuir-Blogett Film）技术建立DEAE琼脂糖膜，通过液质联用和蛋白酶切技术结合研究吸附蛋白质的结合位点，通过石英晶体微天平和原子力显微镜研究吸附蛋白质的空间结构信息，实现对离子交换层析中蛋白质吸附状态的直接检测，研究蛋白质吸附行为的变化规律及调控方法，为离子交换层析纯化过程提供理论指导。

离子交换层析是一种广泛应用于生物大分子的分离、纯化和精制的高效分离方法。蛋白质在离子交换层析介质表面的吸附行为是国内外的研究热点。研究蛋白质在层析介质上的吸附行为，能从分子水平上研究吸附-解吸过程，有助于深入了解离子交换层析的反应机理，从而制备高效新型的离子交换层析介质。本项目建立了DEAE琼脂糖LB膜制备方法，简化了DEAE离子交换层析介质界面，制备的DEAE琼脂糖LB膜表面平整，厚度约为7.9nm，为蛋白质在离子交换层析介质界面上吸附行为的研究提供了物质基础。在制备的DEAE琼脂糖LB膜上，研究了配基密度、蛋白类型、分子量等条件对吸附行为的影响，初步探索了蛋白质吸附行为的变化规律，为离子交换层析研究提供理论支持。同样的配基密度条件下，分子量越大的蛋白吸附量越大。对Lys和BSA来说，随着配基密度增加，吸附量增大，吸附速率变快。而IgG在低配基密度下随配基密度增加而吸附量增加，配基密度高于0.016M/L后吸附量基本一致，说明由于IgG的空间位阻影响，增加配基密度不能带来吸附量的增加。研究了多聚亚基蛋白乙肝疫苗在硫酸铵溶液中的聚集情况，揭示了溶液环境对蛋白质结构的影响，为探索复杂蛋白在离子交换层析介质界面的吸附行为奠定了基础和开拓了思路。结果表明，低浓度硫酸铵条件下HBsAg聚集成寡聚体形式，当硫酸铵去除后，抗原活性尚可恢复到较高的水平；而高浓度条件下HBsAg迅速聚集成大颗粒聚集体，并且在除去盐的条件下不可逆，所以抗原活性永久丧失。