猪viperin抑制猪瘟病毒复制的机制和分子基础研究

Classical swine fever (CSF) is one of the most important swine infectious diseases and causes large economic loss to pig industry worldwide. The effectors of innate immunity, especially the interferon (IFN), play an important role in anti-viral immune responses. Viperin is one of the IFN-stimulated genes (ISGs). Several researches have confirmed its anti-viral effect for a lot of DNA and RNA viruses. We have confirmed the effect of classical swine fever virus (CSFV) on the expression of viperin in vitro and in vivo; and cloned the viperin gene from pig peripheral blood monouclear cells (PBMC) and found the over-expression of viperin in PK15 showed inhibitary effect on CSFV replication. In this study, PK15, 3D4/21 cells will be transfected with viperin expression plasmid or siRNA to increase or decrease the expression level of viperin, then the change of replicative ability of CSFV, both in RNA and protein levels, will be tested using real-time RT-PCR, Western blot and TCID50 assays; the effect of viperin on different replicative stages (receptor binding, genome replication, protein synthesis and viral release) will be tested; the critical antiviral region of viperin will be identified by construction of a serious of viperin mutants and testing their antiviral ability; furthermore, the co-localization and interaction of viperin with different viral structural or nonstructural proteins will be examined by confocal microscopy and co-IP, to explore the potential mechanism and molecular basis of viperin on CSFV replication. The results will be helpful for explanation of host anti-viral mechanism and design of new protective and control stretagies for CSF.

猪瘟是危害世界养猪业发展的重要疫病。先天免疫效应因子，尤其干扰素，在抗病毒感染中发挥重要作用。Viperin 是重要的干扰素刺激基因，已在多种病毒上证实其抗病毒活性。我们通过体内外试验发现猪瘟病毒（CSFV）感染对viperin的表达有显著影响；进而构建viperin真核表达质粒和细胞系，发现其对CSFV复制具有抑制作用。本研究将在PK15、3D4/21细胞通过瞬时转染和细胞系构建或转染特异的siRNA 提高或降低viperin表达量，接种CSFV 后研究viperin对病毒的抑制作用；检测viperin 对病毒复制不同阶段（结合入胞、基因组复制、蛋白合成、组装释放）的影响；构建系列viperin突变体，确定viperin发挥作用的关键功能区；采用共聚焦和免疫共沉淀技术研究viperin与病毒结构蛋白和非结构蛋白共定位、相互作用的情况。综合解析viperin 影响病毒复制的机制和分子基础。

先天免疫是机体抵抗感染的第一道防线。先天免疫的重要成员干扰素，通过诱导产生多种干扰素刺激基因（ISG），在抗病毒感染中发挥重要作用。Viperin 是一种重要的干扰素刺激基因，已在多种病毒上证实其抗病毒活性：如HCMV、流感病毒、HCV、DENV等。Viperin抗病毒的机制各有不同。Viperin 与病原感染之间的关系研究主要是在人和部分人畜共患病病毒以及低等生物上开展的，对于猪源Viperin 在重要动物病原感染中的作用鲜有研究。猪瘟病毒（CSFV）是危害养猪业的重要病原，主要依靠疫苗防控，有研究者报道人MxA、猪Mx1、GBP1等能够显著抑制CSFV复制，但其他ISG对CSFV的作用尚未见有报道。为了研究猪Viperin与CSFV的相互作用关系及机制。本研究首先通过体外实验证明猪瘟病毒感染细胞后不能显著诱导Viperin的表达，但会显著抑制Viperin诱导物所引起的Viperin表达，这表明猪瘟病毒具有免疫抑制作用。构建Viperin真核表达质粒和细胞系，Viperin的过表达能够显著抑制猪瘟病毒的增殖，RNAi干扰Viperin的表达后病毒恢复到正常的复制水平。进而探索其对病毒复制抑制作用的机制、功能区及相互作用的蛋白。发现Viperin抑制病毒复制不是发生在病毒结合、入胞和释放阶段，而是在基因组和蛋白复制过程中。这种抑制作用可能是通过Viperin与病毒E2蛋白相互作用实现的。上述结果为CSFV与宿主免疫反应之间的相互作用研究提供理论依据，同时为Viperin对其他动物病毒作用的研究提供基础与材料。