miRNA-21调控靶基因ROCK-1抑制肠上皮细胞损伤的分子机制研究

课题组最新研究发现肠屏障损伤后上皮细胞microRNA（miRNA-21）表达显著下降。本研究将以此为基础，拟从细胞、实验动物及人体标本三个水平探讨miRNA-21对肠屏障的保护作用及机制。通过基因打靶建立肠道条件性敲除（mmu-mir21-IKO）小鼠模型，明确肠屏障受损情况，Argonaute蛋白相关的高通量测序-交联免疫沉淀（HITS-CLIP-AGO）技术检测其靶基因的结合位点；萤光素酶检测法验证miRNA-21与其靶基因ROCK-1的相互作用，并构建抑制和过表达的miRNA-21慢病毒载体转染NCM460细胞验证miRNA-21及ROCK-1对肠屏障的保护作用；临床血清和组织标本检测进一步阐明miRNA-21及ROCK-1与肠屏障损伤的关系。本课题可望为临床肠屏障功能障碍提供早期诊断依据，而miRNA-21的类似物则有望用于肠屏障功能障碍的防治，可为难治性肠衰竭的治疗提供新思路。

近年来在心脏和神经系统中microRNAs有关的研究很多，但在胃肠疾病中的研究较少，前期实验发现细胞miR-21的表达量在肠屏障受损后会显著下降。本研究将从细胞、基因特异性敲除小鼠及临床标本三个水平探讨miR-21 对肠屏障的作用及机制。成功构建肠道条件性敲除（mmu-mir21-IKO）小鼠模型研究miR-21对肠屏障的影响，构建miR-21转染的NCM460细胞系,通过荧光素酶和western blot验证ROCK-1为miR-21的靶基因，miR-21与ROCK-1的3`UTR特异性结合下调ROCK-1的表达，进而上调紧密连接蛋白表达。收集临床标本检测相关指标表达量，检测occludin、Zo-1、IL-6、TNF-α以及降钙素原表达量，显示急性粪石梗阻患者血清miR-21比正常人低，紧密连接蛋白表达下调，进一步验证了miR-21对于肠屏障的作用。通过研究可以从转录后调控水平了解肠屏障功能障碍的发生机制，提高早期诊断率，为临床上治疗肠屏障功能障碍提供新思路，为构建肠屏障早期诊断模型提供一定依据。